폐섬유증 치료기술 개발 수렴형 융합 중개연구센터 = Converging translational research center for the development of pulmonary fibrosis therapeutics

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Ⅰ. Purpose : The aim of this study was to elucidate the pathogenic mechanisms of pulmonary fibrosis and to develop the therapeutics by converging translational research.
Ⅱ. Contents : To analyze the functions of TGase 2 and the endogenous inhibitory proteins and related inflammatory factors To purify, identify and characterize endogenous inhibitor for transglutaminase 2 (TGase 2) To obtain the structural data for complexes of TGase 2 and the binding partners by X-ray crystallography. To develop fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based TGase 2 enzymatic activity monitoring method To develop chemical inhibitors for TGase 2 through elucidation of the pharmacophore of the endogenous TGase 2 inhibitor proteins
Ⅲ. Results
○ Characterization of pulmonary fibrosis-related factors : In bleomycin-induced pulmonary fibrosis mouse model, inflammation and fibrosis decreased in TGase 2 null mice.
○ Identification and characterization of endogenous TGase 2 inhibitor proteins : We purified and identified TIP1 and TIP2 as endogenous TGase 2 inhibitors and analyzed their molecular and cellular roles.
○ X-ray crystallography of the complexes of TGase 2 and the binding partners : We obtained crystals of TIP1, TGase 2/ nucleotides (ATP, AMP, ADP, GTP) and TGse 2/ Ca2+ complexes and solved their three dimensional structures.
○ Development of FRET chemicals for TGase 2 activity assay We synthesized three amine substrates and several acyl substrate for intracellular TGase activity assay. ○ Structure-based chemical compound screening for TGase 2 inhibitor development We obtained two chemical compounds which have approximately 0.5 mM of IC50 for TGase 2 activity from fragment library search.
○ Development of the first reversible fluorescent thiol sensor : We developed a thiol fluorescent probe and optimized it for real-time thiol contents monitoring in living cells.
Ⅳ.Application plans
○ The accumulated knowledge, technologies, and materials in the process of characterizing endogenous TGase 2 inhibitors will also apply to understand the pathogenesis of other TGase 2-related diseases and treat them.
○ The solved three dimensional TGase 2 complex structures will help to understand its activation mechanism.
○ Small chemical compounds selected by using virtual search system will be utilized as lead compounds for development of TGase 2 inhibitors.
○ We will apply reversible thiol reactive electrophiles to develop drugs targeting various proteins containing critical cysteine residues.

국문 초록 (Abstract)

Ⅰ. 연구개발의 목적 : 수렴형 융합중개연구를 통해 난치성 질환인 폐섬유증의 병인기전을 밝혀내고, 이를 치료할 수 있는 원천기술을 개발하고자 함
Ⅱ. 연구개발의 내용 및 범위
폐섬유증 질환 모델 및 환자에서 TGase 2 및 활성억제단백질과 염증 관련 인자들의 기능 분석
트랜스글루타미네이즈2 (TGase 2)의 내인성 활성억제단백질(endogenous inhibitor)의 분리정제 및 동정과 특성 분석
TGase 2-기질 복합체 결정화 및 구조 분석하여 선도물질 최적화를 위한 구조적 정보 획득
Fluorescence resonance energy transfer (FRET) 기술 기반의 실시간 TGase 2 효소 동정법 개발
활성억제단백질의 약리작용단(pharmacophore) 규명 및 유사구조의 화합물 합성을 통한 TGase 2 억제제 개발
Ⅲ. 연구개발결과
○ 폐섬유화 관련 인자 분석
Bleomycin 유도 폐섬유증 모델에서 TGase 2 결핍마우스의 염증반응과 섬유증 증상이 감소함을 확인함. 이러한 과정에 상피세포의 TGase 2가 중요함을 확인함.
○ 내인성 TGase 2 활성억제 단백질 동정 및 특성 분석
내인성 TGase 2 활성억제단백질(TIP1, TIP2)을 동정하여 분자 및 세포 모델과 섬유증 질환 동물 모델에서 그 역할을 확인함.
○ TGase 2와 여러 기질의 복합체 구조 해석
TGase 2와 nucleotide(ATP, AMP, ADP, GTP) 및 칼슘 복합체 결정을 획득하여 3차구조를 밝힘
TIP1의 단백질을 결정화하고 X-선 회절 데이터 획득
○ TGase 2 활성 측정용 FRET 화합물 개발
TGase 활성측정이 가능한 3개의 amine 기질 및 여러개의 acyl 기질 합성하고 amine 및 acyl 기질의 cross-linking에 의해 FRET 측정이 가능함을 확인.
○ 구조기반 TGase 2 활성억제 화합물 개발
Fragment library 검색을 통하여 TGase 2의 닫힌 구조를 안정화시킬 가능성을 가진 14종의 후보 물질 확보하여 0.5mM 수준에서 50% 활성억제를 보이는 2종의 화합물 최종 획득함.
○ 최초의 가역적 thiol 형광센서 개발
Thiol 화합물과의 반응을 통해 형광변화를 나타내는 형광탐지자를 합성 및 특성 분석하고 세포내 thiol 반응여부에 따라 형광비율이 변하는 ratiometric 센서로 활용가능함을 확인함
Ⅳ. 연구개발결과의 활용계획
○ 세포내에 존재하는 TGase 2 활성억제단백질에 대한 동정과 특성 분석을 통해 얻은 지식과 기술 및 재료들은 다른 종류의 섬유증을 비롯하여 TGase 2의 활성화가 관여하는 다양한 질환의 발생 기전을 이해하고 치료하는데 적용할 계획임
○ TGase 2/ 칼슘, TGase 2/nucleotide 복합체의 3차구조는 어떻게 TGase 2의 활성이 조절되는지에 대한 해답을 얻는데 결정적인 도움이 되리라 예상함.
○ 가상검색시스템을 통한 확보된 TGase 2 결합 저분자 화합물은 TGase 2 억제제 개발을 위한 선도물질로 활용할 수 있을 것임
○ Thiol 기와 가역적으로 결합할 수 있는 친전자체 화합물의 합성은 thiol기를 활성부위로 가지는 다양한 단백질을 타깃으로 하는 약물의 가역적 억제제 개발에 적용할 계획임