난소암세포주 A2780에 대한 Tamoxifen과 Celecoxib의 세포독성에 관한 연구 : Cytotoxic Effect of Tamoxifen and Celecoxib to A2780 Ovarian Cancer Cell Line

국문 초록 (Abstract)

목적: 난소암은 여성에게 발병하는 암 가운데 가장 사망률이 높은 암으로 1차 항암제에 대해 반응율이 높은 편이지만 재발이 많은 것이 특징이다. 재발되는 경우 약물에 대한 저항성의 발생과 체내 부작용 등으로 치료가 어려워진다. Tamoxifen은 유방암에서 항암효과가 입증되어 난소암의 치료에도 주목 받고 있으며, 선택적COX-2억제제인 celecoxib는 암세포의 성장을 억제한다는 사실이 최근에 여러 역학조사와 실험에 의하여 보고되고 있다. 이들 약제의 특징은 장기간 사용시에도 체내 큰 부작용이 없다는 점이다. 본 연구에서는 항여성호르몬인 tamoxifen과 선택적 COX-2억제제인 celecoxib가 난소암 세포에 미치는 영향과 상호작용에 대해서 조사하고 그 작용기전을 밝히고자 하였다.
실험 방법: 상피성 난소암세포주인 A2780에서 tamoxifen과 선택적 COX-2 억제제인 celecoxib 의 처리 농도 변화에 따른 항암활성 변화와 병용 투여시의 항암활성의 변화를 세포의 형태학적 관찰과 MTT assay를 통하여 분석하였다. 또한 이들 약제에 의해 세포자멸사가 유발되는 과정을 절단 PARP 분율과 caspase-3 활성도 측정, 그리고 flow cytometry 분석을 이용해 규명하고자 하였다.
결과: 상피성 난소암세포주인 A2780를 24동안 지속적으로 각각의 약제에 노출시킨 결과, 두 약제 모두 대조군에 비해 유의하게 세포독성이 높게 나타났다. 또한 tamoxifen을 단독 투여하는군 보다 동시에 두 약제를 같이 투여하는 경우 세포독성이 유의하게 증가하였다. MTT assay, 절단PARP 분율 측정을 통한 caspase-3 활성도 검사, 그리고 flow cytomety를 이용한 세포자멸 분율 측정에서는 대조군보다 단독 투여군에서, 단독 투여군보다 동시 투여군에서 세포독성이 유의하게 높게 나타났으며 그 과정에caspase-3 pathway가 관여할 가능성이 큰 것으로 나타났다.
결론: 난소암세포주인 A2780에 대해 antiestrogen인 tamoxifen과 COX-2 억제제인 celecoxib는 어느 정도의 항암효과가 있는 것으로 판단되며 병합 투여하는 경우 부가작용 이상을 치료효과를 보이는 것으로 판단된다. 신체 부작용이 적고 효과적인 새로운 난소암 약물 요법을 개발하기 위해서는 향후 임상실험 등 추가 연구가 필요할 것으로 사료된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Objective: Epidemiological evidence strongly suggests that steroid hormones, primarily estrogens are implicated in ovarian carcinogenesis. And there are evidences that some epithelial ovarian cancer cells respond to hormonal therapy. However, it has proved difficult to fully understand mechanisms of action of this hormone on the tumorigenic process. New convincing data have indicated that estrogens favor neoplastic transformation of the ovarian surface epithelium. Cyclooxygenases (COX) catalyze the conversion of arachidonic acid to prostaglandins. COX-2 is highly inducible by diverse stimuli including cytokines, growth factors, mitogens, and tumor promoters and also regulates inflammation, differentiation, mitogenesis, and angiogenesis . Overwhelming evidence suggests a role for COX-2 in a variety of cancers. COX inhibitors primarily interfere with prostaglandin biosynthesis by inhibiting COX enzymes. Research primarily focusing on colorectal cancer has provided mounting evidence that COX inhibitors are effective in cancer prevention and possibly for adjuvant therapy in the treatment of established tumors. Also there have been evidences that treatment of various human cancer cell lines with selective COX-2 inhibitors induces apoptotic cell death. The goal of this article is to evaluate the effects of antiestrogen, tamoxifen and a selective COX-2 inhibitor, celecoxib on the ovarian cancer cells and the benefits of combining these agents in the management of ovarian cancer.
Methods: A2780 epithelial ovarian cancer cells were exposed to increasing concentration of tamoxifen (10-8 M, 10-7 M, 10-6 M, 10-5 M and 10-4 M) and celecoxib (10-8 M, 10-7 M, 10-6 M, 10-5 M and 10-4 M) as well as a combination of both drugs. The activity of apoptosis was evaluated by MTT assay and the pattern of apoptosis was also assessed by the caspase-3 activity, the fraction of cleaved PARP (poly ADP-ribose polymerase) protein, and flow cytometric assay using annexin V.
Results: Single application of both drugs could significantly increase the rate of apoptosis after 24 h of continuous exposure. Concomitant treatment of A2780 cells with tamoxifen and celecoxib induced significant increase in apoptosis, comparing with single drug exposure. The pattern of apoptosis induced by these agents on A2780 cells seemed to be caspase-3 dependent.
Conclusion: Our data suggest that combining tamoxifen with selective COX-2 inhibitor seems to have at least an additive tumoricidal effect. A more definitive role for this combination therapy in clinical settings in ovarian cancer will need to be defined through the conduct of clinical trials.

목차 (Table of Contents)

• 서론 = 1
• 연구 대상 및 방법 = 4
• 1. 세포배양 = 4
• 2. Celecoxib 및 Tamoxifen 처리 = 4
• 3. MTT assay (세포 생존율 검사) = 5
• 4. 절단 PARP (poly ADP-ribose polymerase) 단백 분율 측정 = 6
• 5. Caspase-3 activation 측정 = 7
• 6. Flow cytometry 분석 = 8
• 7. 통계 처리 = 8
• 결과 = 10
• 1. MTT 분석을 통한 세포 생존율 측정 = 10
• 2. Western blot을 이용한 PARP 단백질 절단 확인 = 11
• 3. Caspase-3 활성도 측정 = 12
• 4. Flow cytometry 분석을 이용한 세포자멸 분율 측정 = 13
• 고찰 = 15
• 참고문헌 = 25
• 부록 = 33
• Abstracts = 41