Characterization of pFMBL1, a small cryptic plasmid from Leuconostoc mesenteroides SY2, and its use as a cloning vector

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

A 4661 bp cryptic plasmid pFMBL1 was isolated from Leuconostoc mesenteroides SY2 and characterized. The nucleotide sequence analysis revealed two open reading frames, ORF1 and ORF2. The ORF2 was 453 bp in size and showed 58% homology with the putative replication initiation protein of Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides Y110 cryptic plasmid, pTXL1. The pFMBL1 harbors a minimal replicon localized on a 3551bp fragment. A cloning vector for Leuconostoc was developed on the basis of the pFMBL1 minimal replicon, into which were inserted an erythromycin resistance gene as a marker and Escherichia coli ColE1 replication origin. This cloning vector is named pSJ33E. The pSJ33E was not detected single-stranded intermediate and was very stable without antibiotic selection still 2 weeks. Therefore, we expected that the pSJ33E is replicated in theta mechanism. About 565 nucleotides transcribed from ORF2 confirmed as result that northern blot analysis of pSJ33E.

국문 초록 (Abstract)

Leuconostoc 속은 식품 산업에 공통적으로 사용되는 이상발효 균이다. 김치 공장에서 생산되는 김치의 양이 계속적으로 증가하고 이런 경향은 김치의 질을 일정하게 유지하게 하는 여러 가지 요인들에 대한 연구를 필요로 하게 하였다. 치즈와 요구르트와 같은 많은 다른 발효 식품과 같이 김치의 질은 유산균에 의한 유산 발효에 의해 크게 좌우된다.
이 논문에서는 Leuconostoc의 특성과 유산발효에 관련하는 여러 효소들의 유전자를 연구하기 위한 기본적인 실험으로 유전자 조작의 기본이 되는 vector를 제조하였고, 그 실험 결과는 다음과 같다.
김치로부터 분리한 Leuconostoc mesenteroides SY2의 cryptic plasmid인 pFMBL1을 분리하여 특성을 조사하였다. 염기서열 분석 결과 이 pFMBL1의 전체 DNA 길이는 4661 bp였고, 2개의 open reading frame과 6개의 inverted repeat을 가지고 있었다. ORF1은 768 bp의 크기를 가지며 Bacillus subtilis의 기능을 알 수 없는 단백질과 28% 상동성을 보였고, ORF2는 453 bp의 크기를 가지며 L. mesenteroides subsp. mesenteroides Y110의 cryptic plasmid인 pTXL1의 복제단백질로 추정되는 단백질과 58% 상동성을 보였다. pFMBL1의 최소복제단위는 ORF1, 2를 포함한 3551 bp였고, 이 최소 복제 단위와 pBluescriptⅡ SK(+)를 연결하여 클로닝 벡터의 기본 골격인 pSJ33을 제작하였다. pSJ33에 선택 마커로 erythromycin 저항 유전자를 도입하여 크기가 약 7.7 kb인 pSJ33E를 제작하였고, pSJ33E에서 ampicillin 저항 유전자를 제거하여 크기가 약 6.5 kb인 pSJE를 제작하였다. pSJ33E는 single strand DNA가 검출되지 않아서 rolling circle type의 복제가 아닌 theta type의 복제를 하는 것으로 추정된다. pFMBL1의 ORF2에서 약 580 bp의 전사체가 검출되었고, 항생제가 없는 배지에서 15일 배양 후에도 약 90%이상의 안정성을 보여 항생제의 첨가 없이도 일정기간 동안 L. mesenteroides에서 외래 유전자의 발현을 유도 할 수 있을 것으로 기대된다

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. Inrtoduction = 1
• Ⅱ. Materials and methods = 3
• 1. Bacterial strains, plasmids, and growth conditions = 3
• 2. Molecular biology techniques = 5
• 3. DNA sequencing and computer analysis = 5
• 4. Detection of single-stranded DNA (ssDNA) in whole-cell lysates of Leuconostoc = 6
• 5. RNA isolation and Northern blot analysis = 7
• 6. Plasmid stability analysis = 9
• Ⅲ. Results and discussions = 10
• 1. Nucleotide sequence and general features of pFMBL1 = 10
• 2. Minimal replicon analysis and construction of a shuttle vector = 13
• 3. Replication mechanism of pSJ33E = 16
• 4. Northern blot analysis of the ORFs = 18
• 5. Stability of pSJ33E in L. mesenteroides SY1 = 18
• Ⅳ. Conclusion = 21
• References = 22