Analysis of multi-gene targeting RNAi triggers in the perspective of gene silencing and innate immune activation

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Since the introduction of the original siRNA structure, which harbors 19 bp-long dsRNA region with 2-nt 3' overhangs on both ends, several RNAi triggers that show comparable gene silencing efficiency compared with the original siRNA structure have been reported. However, when devising complex RNAi structures with unique structural features and functionalities, the possibility of non-specific phenomena such as innate immune stimulation by complex RNA structures should be carefully addressed. Herein, I evaluated immunogenicity of complex RNAi triggers, chemically synthesized long dsRNAs and tripodal RNA (tiRNA), which allow multiple target gene silencing. First, I found that blunt-ended tiRNA induced RIG-I-mediated innate immune response, which was suppressed by the introduction of the 2-nt 3' overhang structure. Additionally, I found that linear 16 bp-long dsRNA arm is an immunogenic determinant of tiRNA structure. Second, I found that RIG-I-mediated innate immune stimulation by chemically synthesized long double-stranded RNAs is structure- and sequence-dependent. Surprisingly, in contrast to earlier reports that focused on the sequence of single-stranded RNA, I found that sequence composition of dsRNA termini is important for sequence-dependent RIG-I activation. Third, I identified that tiRNAs and long dsRNAs over 38 bp could elicit multiple target gene silencing, suggesting that those structures can be novel RNAi therapeutics platforms. Taken together, the findings in this study may serve as guidelines to develop an immunostimulatory RNAi trigger to exploit host’s innate immune system as well as a specific multi-gene targeting RNAi therapeutics platform without non-specific innate immune stimulation via RIG-I.

국문 초록 (Abstract)

19 bp 길이의 이중 가닥 RNA의 양쪽 말단에 2-nt 3' overhang가 있는 siRNA의 구조가 보고된 이후로, 이 siRNA와 비슷한 수준의 유전자 침묵 효과를 보여주는 많은 RNA 구조체들이 보고되었다. 그러나 독특한 구조와 특수한 기능성을 가지는 복잡한 RNA 구조체들은 선천성 면역반응과 같은 비특이적 반응을 일으킬 수 있다. 따라서 이 RNA 구조체를 치료제로 이용하기 위해서는 각 구조체들이 일으키는 비 특이적 반응들을 반드시 평가하고 또한 최소화할 수 있어야한다. 본 연구에서는 복수의 유전자를 동시에 침묵시킬 수 있는 화학적으로 합성된 긴 이중 가닥 RNA 및 세 개의 짧은 이중 가닥 RNA를 가진 tripodal RNA (tiRNA)가 일으키는 면역반응을 평가하였다. 첫째, blunt 말단을 가진 tiRNA는 RIG-I를 통한 선천성 면역반응을 일으켰으나, 2-nt 3' overhang을 이중 가닥 RNA 말단에 부착하므로 선천성 면역반응의 유도를 억제할 수 있었다. 또한 tiRNA 구조에서 16 bp 길이의 선형 이중 가닥 RNA가 RIG-I 매개 면역반응을 일으키는데 중요한 요소인 것을 밝혀냈다. 둘째, blunt 말단을 가지며 화학적으로 합성된 긴 이중 가닥 RNA 또한 RIG-I를 통한 선천성 면역반응을 일으키는 것을 확인하였으며, RNA의 구조뿐만 아니라 이중 가닥 RNA의 염기서열이 RIG-I 활성화에 중요하다는 것을 밝혀내었다. 특히 단일 가닥 RNA의 염기서열이 RIG-I를 활성화시킬 수 있다는 이전 보고들과는 다르게 이중 가닥 RNA의 염기서열, 특히 이중 가닥 RNA 말단에 있는 염기서열이 RIG-I 매개 면역 반응을 유도할 수 있다는 것을 밝혀내었다. 마지막으로 tiRNA와 화학적으로 합성된 긴 이중 가닥 RNA가 일으키는 유전자 침묵 효과를 확인하므로 본 연구에서는 위의 두가지 RNA 구조가 새로운 RNA 간섭 치료제 platform으로 이용될 수 있는 가능성을 제시하였다. 정리하면, 본 연구의 결과는 환자의 면역 체계를 활성화시켜 질병치료에 도움을 주는 RNA 간섭 치료제를 개발하거나 RIG-I를 통한 선천성 면역반응의 유도 없이 복수의 유전자를 서열 특이적으로 침묵시킬 수 있는 새로운 RNA 간섭 치료제 개발에 중요한 단초를 제공할 것이다.

목차 (Table of Contents)

• Chapter 1. Introduction 1
• 1. RNA interference 1
• 2. Multi-Gene Silencing Strategy 3
• 3. Innate Immune Stimulation by Double-Stranded RNA 6
• 4. The Goal of This Study 9
• Chapter 2. Tripodal RNA with 3' Overhangs Prevents RIG-I-Mediated Innate Immune Response 19
• 1. Introduction 19
• 2. Materials and Methods 22
• 3. Results and Discussion 27
• Two-nucleotide overhang at the 3' ends blocks the immune response of tiRNA by inhibiting the activation of RIG-I 27
• Analysis of the immunogenic determinant of tiRNA structure in mouse macrophage 29
• Analysis of target gene silencing by variants of tiRNAs 31
• Chapter 3. RIG-I Mediated Innate Immune Stimulation by Chemically Synthesized Long Double-Stranded RNAs Is Structure- and Sequence-Dependent 53
• 1. Introduction 53
• 2. Materials and Methods 57
• 3. Results 61
• Chemically synthesized long dsRNAs trigger efficient gene silencing in Dicer-independent manner 61
• Long dsRNAs with blunt ends elicit innate immune responses 62
• Long dsRNAs with blunt ends trigger RIG-I mediated innate immune response 65
• Long dsRNAs with blunt ends activate RIG-I in a structure- and sequence-dependent manner 66
• Sequence composition at blunt-end termini of dsRNA is important for sequence-dependent RIG-I activation 69
• 4. Discussion 70
• Chapter 4. Conclusion 94
• References 99
• 논문요약 117

참고문헌 (Reference)

1. RNA interference ., Hannon , G. J ., 418 ( 6894 ) , 244-251 ., , 2002

2. RNA interference ., Downward , J ., 328 ( 7450 ) , 1245-1248 ., , 2004

3. Nucleic acid immunity, Hartmann , G., 133 , 121-169, , 2017

4. Givosiran : first approval, Scott , L. J ., 80 ( 3 ) , 335-339 ., , 2020

5. Double-stranded RNA sensors and modulators in innate immunity, Hur , S., 37 , 349-375 ., , 2019

6. Gene-silencing technology gets first drug approval after 20-year wait, Ledford , H., 560 ( 7718 ) , 291-293, , 2018