도파민 합성 모니터링용 Aromatic L-amino acid decarboxylase(AADC) 리포터 세포주 제작을 위한 아데노바이러스 기반 CRISPR/Cas9 벡터 개발 = Development of Adenovirus-Based CRISPR/Cas9 Vector for Production of Aromatic L-amino acid decarboxylase(AADC) Reporter Cell Line for Dopamine Synthesis Monitoring

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Aromatic L-amino acid decarboxylase(AADC or AAAD)는 잘 알려진 모노아민 신경전달물질의 전구체로 감정 조절, 자율신경 조절, 호흡 등을 비롯한 다양한 생리적 기능 및 행동과 관련 있는데, AADC 유전자에 돌연변이가 생겨 결핍이 발생하면 AADC 활성이 심각하게 감소되는 현상이 발생한다. AADC 유전자는 여러 도파민성 신경 물질의 기전에 관여하므로, 연구의 가치가 있다고 판단되는 유전자이다. 그러므로, AADC를 발현하며 신경성 유전자를 연구하는데 주로 쓰이는 인간 신경모세포종 세포(SH-SY5Y)를 사용하여 질병 모델링 및 약물 스크리닝 등에 사용하고자 해당 세포에 리포터 세포주를 만들기 위해 CRISPR/Cas9 유전자 편집 기술을 도입한 유전자 전달 재료를 제작하였다. 이때, 세포에는 Cas9/gRNA와 HDR donor DNA가 전달되어야 한다. Cas9/gRNA은 Cas9 protein과 AADC sgRNA가 하나의 플라스미드 형태로 되어 있는 all-in-one 플라스미드 벡터와 all-in-one 아데노바이러스를 제작하였다. HDR donor DNA도 마찬가지로 플라스미드 벡터와 아데노바이러스 형태로 제작하였다. 바이러스 형태의 운반체는 플라스미드보다 세포 내 전달 효율이 더 높다는 장점이 있는데, all-in-one 플라스미드와 all-in-one 아데노바이러스가 정상적으로 작동하는지 그 발현 여부를 FACs를 통해 확인하였다. 또한, 리포터 세포주 제작에 있어 Cas9/gRNA의 운반체의 표적 유전자 절단 효율이 높을수록 Knock-in 효율도 올라가므로, 이를 비교하고자 T7E1 assay를 실시하였다. sgRNA-1, sgRNA-2, sgRNA-3 라는 각각 다른 sgRNA에 대한 all-in-one 플라스미드를 transfection 및 electroporation을 통한 T7E1 assay 결과에서 transfection에서 각 5.72 %, 4.62 %, 10.17 %, electroporation에서 각 6.72 %, 5.62 %, 13.24 %의 indel 효율이 있음을 확인하였으며, indel 효율이 가장 높은 sgRNA-3을 선택하여 all-in-one 아데노바이러스를 제작하였다. all-in-one 아데노바이러스를 transduction한 T7E1 assay 결과에서 18.27%의 indel 효율을 확인하였다. 아데노바이러스를 활용하는 것이 더 유의미한 결과를 나타내었다.

목차 (Table of Contents)

• LIST OF TABLES i
• LIST OF FIGURES iii
• 국문 요약 · vi
• 제1장 서론 1
• 제1절 CRISPR/Cas9 유전자 편집 기술 · 1
• 1.1.1. CRISPR/Cas9의 개념과 작동 원리 1
• 1.1.2 CRISPR/Cas9의 세포 내 전달 방법 4
• 제2절 아데노바이러스의 활용 동향 7
• 제3절 리포터 세포주 · 10
• 제4절 인간 게놈의 AADC 유전자 13
• 제5절 연구 목적 및 수행 전략 17
• 제2장 본론 · 19
• 제1절 CRISPR/Cas9 AADC knock-in 재료 제작 19
• 2.1.1. CRISPR/Cas9 AADC sgRNA all-in-one 플라스미드 벡터 제작 19
• 2.1.1.1. AADC gRNA 선정 · 19
• 2.1.1.2. Cas9/AADC sgRNA all-in-one 플라스미드 벡터 제작 30
• 2.1.2. HDR donor DNA 제작 34
• 2.1.2.1. HDR donor DNA 클로닝 · 34
• 2.1.2.2. HDR HA donor DNA 선형화 · 62
• 제2절 CRISPR/Cas9 AADC knock-in 아데노바이러스 벡터 재료 제작 68
• 2.2.1. Cas9/AADC sgRNA all-in-one 아데노바이러스 벡터 제작 68
• 2.2.2. HDR HA donor DNA 아데노바이러스 벡터 제작 78
• 제3절 CRISPR/Cas9 벡터의 효율 확인 85
• 2.3.1. CRISPR/Cas9 플라스미드 벡터의 효율 확인 85
• 2.3.1.1. Cas9 AADC sgRNA all-in-one 를라스미드 벡터의 Transfection 효율 85
• 2.3.1.2. T7E1 assay (Transfection) 88
• 2.3.1.3. Cas9-AADC sgRNA all-in-one 플라스미드 벡터의 Electroporation 효율· 95
• 2.3.1.4. T7E1 assay (Electroporation) 98
• 2.3.2 CRISPR/Cas9 아데노바이러스의 효율 확인 · 102
• 2.3.2.1. 바이러스 입자 생성 확인 · 102
• 2.3.2.2. 아데노바이러스 역가 측정 105
• 2.3.2.3. Cas9-AADC sgRNA all-in-one 아데노바이러스의 Transduction 효율 110
• 2.3.2.4. T7E1 assay (Transduction) 112
• 제4절 CRISPR knock-in 세포의 실험 활용 방안 · 116
• 제3장 결론 118
• 참고문헌 119
• Abstract · 130