알코올 음료 제조를 위한 Ganoderma applanatum 액체배양의 최적화 = Optimization of Submerged Cultivation from Ganoderma applanatum for Production of Novel Alcohol Beverages

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

This study was conducted for the production potential and optimization of a novel functional alcohol beverage through submerged cultivation of Ganoderma applanatum. The optimization of culture condition and medium for the maximum production of mycelial growth, exo-polysaccharide and alcohol dehydrogenase activity from the G. applanatum were examined by response surface methodology and mixture experiments design, respectively. Also, alcohol fermentations of wine and beer was performed using G. applanatum mycelium obtained by cultivation under optimum culture condition and medium. A flask cultivation of G. appolanatum with addition of T. matsutake ethanol extract as substrate into liquid media was conducted, and a new process by two-staged substrate addition, which the extracts were added and maintained at end period of cultivation was intended for the effective cultivation. Effect of cultured products on antioxidation and fibrinolytic activity were evaluated by comparing with the submerged culture of G. applanatum without T. matsutake ethanol extract. The obtained results were as follows.
1. Specific activity of alcohol dehydrogenase (ADH) was measured from mycelium cultured of ten genera mushrooms. The orders of ADH specific activity were Phellinus linteus (100.09 U)〉Lentinus edodes (75.56 U)〉Agaricus blazei (67.52 U)〉Cordiceps militaris ~ Ganoderma applanatum (48.64 ~ 48.34 U)〉Inonotus obiliquus (30.29 U)〉Grifola frondosa (26.27 U). Since ADH activity for alcohol brewing of Agaricus blazei, Tricholoma matsutake, Lentinus edodes, Flammulina velutipes, Phellinus linteus, and Pleurotus ostreatus were reported by other researchers, Ganoderma applanatum was selected as an isolate strain except for these six genera mushrooms.
2. From the results of response surface analysis and mixture experiment for the optimum culture condition and medium at flask culture, the composition of optimum medium for submerged culture of G. applanatum were dextrose 19.08 g/L, sucrose 12.72 g/L, yeast 8.80 g/L, peptone 3.54 g/L, casamino acid 5.21 g/L, KH₂PO₄ 2.69 g/L, K₂HPO₄ 5.80 g/L and MgSO₄ 2.91 g/L, and the optimum culture conditions were obtained at agitation speed of 120 rpm, inoculum volume of 5.12%(v/v) and pH of 5.39.
3. Fermentations of wine and beer were performed using mycelium of G. applanatum cultured using optimized culture condition and medium. G. applanatum produced alcohol in both the aerobic and anaerobic conditions. The ability of alcohol production was improved by shaking after standing culture method more than standing or shaking culture alone. However, the production level of alcohol was much lower than hat of typical alcohol fermentation using S. cerevisiae.
4. When T. matsutake ethanol extract (1∼9%, v/v) was added into a medium in submerged cultivation of G. applanatum, addition of T. matsutake ethanol extract in the range of concentration of 3∼9%(v/v) inhibited the mycelial growth of G. applanatum. This inhibition was supposed to be an action of the ethanol and/or antifungal ingredient from T. matsutake extract as substrate. Therefore, we confirmed that the cultivation of G. applanatum in a medium containing high concentration (3%>) of T. matsutake ethanol extract could not be submerged cultured. For that reason, the two-staged addition of T. matsutake ethanol extract, that is, the addition of T. matsutake ethanol extract by changing a addition time of T. matsutake ethanol extract after cultivation of 0 to 5 days without T. matsutake ethanol extract was intended. When T. matsutake ethanol extract was added at logarithmic phase of mycelial growth after cultivation of 5 days, the inhibition of mycelial growth was effectively prevented indicting the possibility of submerged cultivation in high ethanol containing medium.
5. The two-staged addition of T. matsutake ethanol extract, that was T. matsutake ethanol extract of 5% was added into culture fluids of G. applanatum mycelial growth after cultivation of 5 days under optimal medium obtained using mixture experiments design, and then was successively cultivated for 8 days by using response surface methodology. Optimum culture condition was obtained at pH of 5.37, agitation speed of 120 rpm and inoculum of volume 5.65%. and theoretical maximum value obtained using response surface analysis was mycelial dry weight of 8.91 g/L and exo-polysaccharide of 4.99 g/L .
6. The culture broth obtained by using two-staged T. matsutake ethanol extract addition technique was contained ethanol level more than 90% from the original ethanol content. The total phenolic compounds contents from culture broth of G. applanatum of addition T. matsutake ethanol extract were 2∼4 folds higher than those of control (T. matsutake ethanol extract). The culture broth exhibited no fibrinolytic activity. However, the antioxidant activity using DPPH (1,1-diphenyl- 2-picryl hydrazyl) radical scavenging assay was 68∼91%, and these activities were much higher than 27∼57% of T. matsutake ethanol extract alone, indicating a modification effect by this established cultivation method.
Therefore, it was found that the submerged cultivation of G. applanatum using two-staged T. matsutake ethanol extract addition technique would provide a potential method for novel functional alcohol beverages.

국문 초록 (Abstract)

본 연구는 잔나비불로초 버섯의 액체배양을 통한 알코올 음료 제조 가능성과 액체배양의 최적화에 대한 연구의 일환으로 수행되었다. 최대의 균사체 배양, 알코올 탈수소 효소의 생성 및 세포외 다당 생성을 위해 혼합물실험법 및 반응표면분석법에 의해 각각 배지 및 배양의 최적화를 실시하였고, 얻어진 최적 조건하에서 배양한 균사체를 이용하여 알코올 발효를 시도하였다. 또 , 각종 생리 기능성과 풍부한 영양분을 가지고 있는 송이의 에탄올 추출물을 기질로 첨가하여 배양하는 새로운 액체배양을 시도하여 고농도 에탄올하의 2단계 기질 첨가 배양공정을 검토하였다. 아울러, 이에 의해 생성되는 배양생성물의 몇몇 생리 기능성을 송이 에탄올 추출물과 비교, 조사하여 그 효과를 규명하였으며, 다음의 결과를 얻었다.
1. 우수한 ADH 활성을 지니는 버섯 종을 탐색하고자,생물신소재 연구실에 보관중인 10종의 버섯 균주를 배양하여 각각의 ADH의 비활성을 조사한 결과, 상황(100.09U) 〉표고(75.56U) 〉신령버섯(67.52U) 〉동충하초·잔나비불로초(48.64 ~ 48.34U)〉차가버섯(30.29U)〉잎새버섯(26.27U)의 순이었다. 이미 ADH의 활성에 대해 보고된 바 있는 신령, 표고, 느타리, 송이, 팽이, 상황 등 6종의 버섯을 제외하고 비교적 ADH 활성이 가장 높았던 잔나비불로초를 공시균주로 선정하였다.
2. 잔나비불로초 버섯의 플라스크 배양을 위한 배지조성과 배양조건의 최적화를 각각 혼합물실험법 및 반응표면분석법으로 수행한 결과, 최적 배지 조성은 dextrose 19.08 g/L, sucrose 12.72 g/L, yeast8.80 g/L, peptone 3.54 g/L, casamino acid 5.21g/L, KH₂PO₄ 2.69g/L, K₂HPO₄ 5.80g/L, MgSO₄ 2.91g/L이었으며, 최적배양조건은 pH 5.39, 교반속도 120rpm, 접종량 5.12%에서 얻어졌다.
3. 혼합물실험법 및 반응표면분석법에 의해 최적화된 배지조성과 배양조건으로 수행된 잔나비불로초의 균사체를 이용하여 와인 및 맥주 발효를 수행하였다. 잔나비불로초는 혐기적 및 호기적 모두에서 알코올 발효능을 가졌으며, 정치 또는 진탕배양에 비해 진탕배양 후 정치배양하는 방법으로 알코올 수율을 향상시킬 수 있었다. 하지만 효모발효에 비해 알코올 발효능이 매우 낮았다.
4. 잔나비 불로초 버섯에 의한 알코올 발효능이 매우 낮았으므로 각종 생리활성이 기대되는 송이 에탄올 추출물(1∼ 9%,v/v)을 초기 기질로 하여 잔나비불로초 버섯의 액체배양을 시도하였다. 그 결과, 3% 이상의 고농도 알코올에서 배양 초기에 생육 저해현상이 나타남을 보였다. 이는 기질 속에 함유되어 있는 에탄올과 항균성물질의 작용에 의해 기인하는 것으로 생각되었다. 이와 같이 초기 기질로서 고 농도의 송이 에탄올 추출물을 함유한 잔나비불로초 버섯의 액체배양은 수행이 불가하였으므로 이의 해결을 위해 잔나비불로초 버섯의 액체배양 중 송이 에탄올 추출물의 첨가 시기를 달리하여 2단계로 첨가, 배양하는 2단계 기질 첨가 배양법을 시도하였다. 그 결과, 첨가시기를 늦출수록 균사생육의 저해현상이 일어나지 않음이 관찰되었다. 특히, 균사체 증식이 충분히 이루어진 배양 5일 이후에 송이 에탄올 추출물을 첨가하였을 때 균사의 생육저해 없이 고농도 에탄올 기질하의 액체배양이 가능한 결과를 얻었다.
5. 혼합물실험법으로 얻은 최적배지 조성으로 균사생육이 충분히 이루어진 배양 5일째에 잔나비불로초 버섯 배양액에 송이 에탄올 추출액을 최종 에탄올 함량이 5%(v/v)가 되도록 무균적으로 첨가하여 8일 동안 추가배양하는 2단계 기질 첨가배양법을 반응표면분석법을 이용하여 분석하였다. 그 결과, 최적 배양조건은 pH5.37, 교반속도 120rpm 접종량 5.65%이었다. 이 최적조건으로 2단계 기질첨가 배양법을 수행할 경우, 이론값은 건조 균체량 8.91 g/L 그리고 세포외 다당은 4.99 g/L 이었다.
6. 2단계 배양법으로 얻은 배양 생성물은 첨가된 에탄올의 90% 이상을 함유하였고, 첨가구는 대조구보다 항산화의 지표성분으로 볼 수 있는 총 페놀성 화합물의 함량이 각각 약 2∼ 4배 증가하여 발효수식의 효과가 확인되었다. 또, 송이즙에서 나타나는 혈전용해 활성은 없었으나 DPPH 라디칼 소거능에 의한 항산화 활성은 송이에탄올 추출물의 약 27∼ 57%보다 크게 향상된 약 68∼ 81%의 값을 얻을 수 있었다. 따라서 송이 에탄올 추출물의 2단계 기질 첨가 배양법에 의한 잔나비 불로초의 액체배양으로 얻어진 배양액은 향상된 항산화 활성 등의 생리 기능성을 갖는 새로운 기능성 알코올 음료로서 가능성이 기대되었다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서론 = 1
• Ⅱ. 재료 및 방법 = 6
• 1. 재료 = 6
• 2. 균주 및 보존 = 6
• 3. 배지조성 및 조제 = 6
• 4. 배양방법 = 6
• 5. 잔나비불로초에 의한 알코올 발효 = 9
• 6. 분석방법 = 9
• 1) 균사체 및 세포외 다당 = 9
• 2) 페놀성 화합물의 정량 = 12
• 3) Alcohol dehydrogenase의 활성 측정 = 12
• 7. 혼합물실험법(Mixtureexperiment) = 13
• 8. 반응표면분석법(Responsesurfaceanalysis) = 13
• 9. 생리활성의 측정 = 16
• 1) 항산화 활성의 측정 = 18
• 2) 혈전용해활성 측정 = 18
• 10. 균사체의 형태 관찰 = 18
• Ⅲ. 결과 및 고찰 = 20
• 1. 버섯 균사체의 액체배양에 의한 ADH 활성 조사 및 균주 선발 = 20
• 2. 잔나비불로초(G. applanatum)의 액체배양의 ADH 효소의 특성 = 22
• 3. 잔나비불로초(G. applanatum) 액체배양의 최적화 = 27
• 1) 혼합물실험법에 의한 최적 배지조성의 검토 = 27
• 2) 반응표면분석법에 의한 최적 배양조건 검토 = 36
• 4. 잔나비불로초에 의한 알코올 발효 = 44
• 5. 잔나비불로초의 액체배양에 의한 버섯 에탄올 추출물의 발효 = 56
• 1) 버섯의 고체배양에 미치는 버섯 에탄올 추출물 첨가의 영향 = 56
• 2) 잔나비불로초의 액체배양 중 송이 에탄올 추출물 첨가 영향 = 57
• 3) 잔나비불로초의 액체배양에 미치는 송이 에탄올 추출물의 첨가 시기의 영향 = 62
• 4) 반응표면분석법에 의한 2단계 기질 첨가 배양법의 최적화 = 76
• 6. 송이 에탄올 추출물을 첨가한 잔나비불로초 액체배양의 생리활성 = 84
• 1) 혈전용해 활성 = 84
• 2) 항산화 활성 = 91
• Ⅳ. 결론 = 96
• Ⅴ. 문헌 = 99
• SUMMARY = 107