애기장대 oxidosqualene cyclase 유전자와 돌연변이체의 분리 및 특성 분석 = Isolation and characterization of Arabidopsis oxidosqualene cyclase genes and their mutants

국문 초록 (Abstract)

Oxidosqualene cyclases (OSCs)는 2,3-oxidosqualene을 cyclization하는 과정에 관여하는 효소이다. 식물에서는 이러한 OSC에 의해 다양한 triterpenoids가 생성되며, 이들은 식물의 성장과 발달 및 방어기작에 관여하는 것으로 알려져 있다. 애기장대 (Arabidopsis thaliana)에서 OSC 유전자들에 의해 생성되는 다양한 triterpenoids의 기능을 연구하기 위하여 애기장대에 존재하는 6개 OSC 유전자들을 확보하였으며, 그 이름을 AtOSC1에서 AtOSC6으로 명명하였고, 계통 발생학적으로 분석하였다. 식물의 각 조직 부위별로 6개 OSC 유전자들의 mRNA 발현 양상을 분석한 결과, AtOSC2, AtOSC3 및 AtOSC6 (marneral synthase, MRN1)은 유묘와 뿌리에서, AtOSC4는 꽃과 silique에서 특이적으로 발현되었으며, AtOSC1과 AtOSC5는 거의 발현되지 않았다. 또한, 애기장대 유묘에서 다양한 식물 호르몬과 abiotic 스트레스 처리에 의한 6개 OSC 유전자들의 mRNA 발현 양상을 살펴 본 결과, 특히 MRN1 유전자의 전사체가 ABA, JA, H2O2, Mannitol 및 NaCl에 의해 적어도 5배 이상 증가됨을 확인하였다. MRN1 유전자의 생물학적 기능을 알아보기 위하여 MRN1 유전자에 T-DNA가 삽입된 돌연변이체를 분리하여, genomic Southern blot과 역교배 분석을 통해서 mrn1 돌연변이체에 한 개의 T-DNA가 삽입된 것을 확인하였다. mrn1 돌연변이체의 성장과 발달을 관찰해 본 결과, 개화시기가 지연되었고, 잎의 길이 성장이 억제되었으며, 수술 filament의 성장이 억제되었고, 수정이 잘 일어나지 않았다. 이러한 mrn1 돌연변이체의 표피세포를 주사전자현미경으로 관찰했을 때, 세포의 분열과 성장에 이상이 있음을 확인하였다. mrn1 돌연변이체는 배 발생이 지연되거나 억제 되었으며, 종자 형태가 비정상적이며 mucilage의 생성도 억제되었다. 그리고 발아율이 떨어지며, 뿌리의 생장이 억제되는 것이 관찰되었다. 또한, mrn1 돌연변이체의 뿌리와 callus에서 sterol 함량을 분석한 결과, β-sitosterol의 함량이 약 15 ~ 30 mol% 증가되었으며, stigmasterol의 함량이 약 50mol% 감소된 것을 확인하였다. 그리고 MRN1 유전자의 promoter를 분석하기 위하여 MRN1 유전자의 약 1.8 kb upstream 부위를 확보하여 GUS reporter 유전자에 부착하였다. 이러한 연구 결과는 애기장대에 존재하는 MRN1이 식물의 성장과 발달에 중요한 기능을 수행할 것이라는 사실을 암시한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Oxidosqualene cyclases (OSCs) is an enzyme, which function in the cyclization of 2,3-oxidosqualene. A various of triterpenoids produced by the OSCs affect plant growth, development, and defence responses against biotic and abiotic stresses. In order to study the functions of the triterpenoids in Arabidopsis, 6 OSC genes were isolated and named as AtOSC1 to AtOSC6. RT-PCR analysis of Arabidopsis OSC genes showed that AtOSC2, AtOSC3, and AtOSC6 (MRN1) transcripts were expressed in seedlings and roots, and AtOSC4 transcripts were expressed in flowers and siliques. However, AtOSC1 and AtOSC5 transcripts were not expressed in all tissues tested. In addition, AtOSC6 (MRN1) transcripts were approximately 5-fold increased by exogenous application of ABA, JA, H2O2, mannitol, and NaCl. The MRN1 gene in Arabidopsis, Arabidopsis mrn1 mutant generated by T-DNA based activation tagging was isolated. Genomic Southern blot analysis and crossing between Arabidopsis wild-type and mrn1 mutant identified that single copy T-DNA was integrated into the MRN1 gene of mrn1 mutant. The mrn1 mutant was characterized by a pleiotrophic phenotype, which includes defective leaf and root growth, delayed flowering, low fertility, defective or delayed embryo development, defective mucilage, and reduced germination rate. Inhibition of cell division and elongation in mrn1 mutant was observed by SEM analysis of epidermal cells from Arabidopsis wild-type and mrn1 mutant. GC-MS analysis showed that the content of β-sitosterol was approximately 15 to 30 mol% increased, but the content of stigmasterol was approximately 50 mol% decreased in roots and callus of mrn1 mutant compared to those of wild-type. Promoter analysis of mrn1 mutant confirmed that mrn1 transcripts were exclusively expressed in root tissues. These findings indicate that MRN1 plays critical roles in plant growth and development.

목차 (Table of Contents)

• 국문초록 = 1
• 서언 = 3
• 재료 및 방법 = 8
• 1. 식물 재료, 돌연변이체 선발 및 생육 조건 = 8
• 2. 애기장대 식물체 교배 = 9
• 3. TAIL-PCR 분석 = 9
• 4. Genomic DNA 분리 및 Southern blot 분석 = 10
• 5. Total RNA 분리 및 RT-PCR 분석 = 10
• 6. Binary 벡터 제조와 애기장대의 형질전환 = 11
• 7. 형질전환식물체에서 GUS 유전자 발현 분석 = 11
• 8. 광학현미경 및 주사전자현미경 (SEM) 분석 = 12
• 9. GC-MS를 이용한 sterol 분석 = 12
• 결과 = 16
• 1. 애기장대 oxidosqualene cyclase 유전자 분리 및 조직 부위별 mRNA 발현 분석 = 16
• 2. 식물 호르몬과 스트레스 처리에 의한 애기장대 OSC 유전자들의 mRNA발현 분석 = 19
• 3. 애기장대에 존재하는 OSC 유전자들의 genomic DNA 정보 및 돌연변이체 확보 = 19
• 4. 애기장대 mrn1 돌연변이체 분리 = 21
• 5. mrn1 돌연변이체의 genomic Southern 분석 및 역교배 = 24
• 6. 애기장대 mrn1 돌연변이체의 성장과 발달 분석 = 26
• 7. SEM을 이용한 mrn1 돌연변이체 표피세포의 분석 = 26
• 8. mrn1 돌연변이체의 배 발생 분석 = 31
• 9. mrn1 돌연변이체 종자의 형태학적 분석 = 33
• 10. mrn1 돌연변이체의 발아 분석 = 33
• 11. mrn1 돌연변이체의 sterol 함량 분석 = 36
• 12. MRN1 유전자 promoter 분리 및 MRN1 유전자 발현 분석 = 36
• 결론 및 고찰 = 41
• 인용문헌 = 47
• Abstract = 56