Characterization of Bacteriocin Produced by Lactobacillus pentosus M8 Isolated from Leaf of Sasa borealis and its Antimicrobial and Potential Probiotic Properties

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Bacteria are a large domain of prokaryotic microorganisms with a typical length in micrometers. Bacteria have a wide range of shapes, ranging from spheres to rods and spirals. There are in the region of ten times as many bacterial cells in the human fauna as there are human cells in the body, with large numbers of bacteria on the skin and as gut fauna (Sears CL, 2005). Most of the bacteria in human body are considered harmless by the protective effect of the immune system, and some even are thought to be beneficial. However, few species of bacteria display harmful effect to human being meaning it causing a disease. These are called pathogenic bacteria. Presence of pathogenic bacteria brings out the necessity of any substance that kills or slows down the growth of pathogenic bacteria; that is antibiotics.
Antibiotics display several ways in killing bacteria. At first, quinolone antibiotics interfere with changes in DNA supercoiling by binding to topoisomerase II or topoisomerase IV. This leads to the formation of double-stranded DNA breaks and cell death in either a protein synthesis-dependent or protein synthesis-independent manner. β-lactams inhibit transpeptidation by binding to penicillin-binding proteins (PBPs) on maturing peptidoglycan strands. The decrease in peptidoglycan synthesis and increase in autolysin leads to lysis which kills the cell. Lastly, aminoglycosides bind to the small (30S) subunit of the ribosome and case misincorporation of amino acids into elongating peptides. Mistranslated proteins cause misfolding and it can lead to increased drug uptake (Kohanski et al., 2010).
Antimicrobial peptides (AMPs) which also called host defense peptides (HDPs) are part of the innate immune response found among almost every single classes of life. They are ubiquitous and natural antibiotics generated by a diverse range of microorganisms, plants, insect and mammalian cells. In recent years, AMPs have drawn a huge attention throughout the world as new antimicrobials to fight against harmful microbes especially those resistant to conventional antibiotics. Number of pathogenic bacteria has evolved mechanisms to overcome these antibiotic-induced cell deaths. These mechanisms are able to either chemically modify the antibiotics or modify target sites so that it is not recognized by certain antibiotics. Due to these reasons, it is important to develop newly advanced antibiotics that can cause antibiotic-induced cell death.
In this study, in an effort to discover a new antimicrobial agent, focus was on bacteriocin produced by Lactic Acid Bacteria (LAB) isolated from Sasa borealis leaf extract. Anti-microbial activity of bacteriocin produced by Lactobacillus pentosus isolate from extract obtained from leaves of Sasa borealis was investigated. First, Bamboo (Sasa borealis) Leaf Extract (BLE) was tested out against numerous bacteria including Gram (+), Gram (-) and also Lactic Acid Bacteria (LAB). Without any concentration steps, BLE showed decent inhibiting ability against both Gram (+) and Gram (-) bacteria. Lactic acid bacteria are considered a probiotic species and were not inhibited by BLE. With this preliminary data, it was clear that extract obtained from leaves of Sasa borealis contains certain type of substance or molecule with decent antibiotic effect. For further research, bacteriocin secreting LAB strains were identified and substance with size of around 65-70 kDa was discovered which was thought to be bacteriocin produced by Lactobacillus pentosus isolate M8.
In a similar manner, bacteriocin produced by Lactobacillus pentosus isolate M8 which displayed a strongest inhibitory activity towards pathogenic bacteria was further investigated. The bacteriocin was shown to be heat, pH stable peptide. Slight decrease in inhibitory action was observed after treatment of enzymes such as catalase and protinase K which confirmed proteinaceous aspect of the peptide. After purification steps, molecular weight of isolated bacteriocin was estimated with Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) and found out to be around 66 kDa. Mechanism of action of isolated bacteriocin was investigated via green fluorescent dye (SYTOX®) which showed disruption of bacterial cellular membrane.
In order to examine probiotic potential of bacteriocin producing LAB Lactobacillus pentosus M8, it was tested to perceive if there are any cytotoxic effects against several cell lines. At first, M8 was tested against normal, unharmful cells such as RAW264.7, J774. As a result, it did not show any cytotoxic effect. Isolate M8 also displayed its inflammation regulatory ability by suppressing LPS-induced Nitric Oxide (NO) production in RAW264.7 and J774 cells respectively.
Bacterial 16S rRNA gene was analyzed via technique called pyrosequencing in order to explore intestinal microbial community in fecal sample of experimental mice treated with Lactobacillus pentosus M8. Most fecal bacteria belonged to two major bacterial phyla; that are Bacteroidetes and Firmicutes. Comparing High Fat Diet (HFD) treated group (Group 2) and LAB (Lactobacillus pentosus M8, Lactobacillus paraplantarum GL and Lactobacillus casei LS2) administered groups (Groups 3, 4, 5), there were quite significant difference in proportion of phyla Bacteroidetes and Firmicutes. Despite the fact that LAB administered groups had as low Bacteroidetes to Firmicutes ratios as STD-treated group, HFD treated group which became progressively obese had Firmicutes enriched microbiome. Accordingly, it was clear that selectivity of LAB attributed to restoration of altered fecal microbiome.

국문 초록 (Abstract)

사람들은 항상 세균에 노출되어 있다. 흔한 감기나 염증에서부터 목숨을 앗아 갈수 있는 질병까지, 세균이 인간에게 미치는 영향은 실로 엄청나다. 이에 사람들은 세균에 대항하는 물질, 즉 항생제를 끊임없이 연구하고 제조해 왔다. 하지만 사람들의 계속된 복용으로 인해 대다수의 항생제에 대한 내성이 점차 생겨나고 있다. 쉽게 말하자면, 세균들도 인간들의 공격에 대해 그 나름의 방식으로 대응, 진화한 것이다. 항생제는 주로 세균 세포의 세포벽 합성 혹은 단백질 합성을 억제하거나, 세포막의 투과성을 변동시키거나, 세균의 물질대사를 억제시키는 등의 기작으로 세균 세포를 사멸시킨다. 하지만 항생제의 오남용 혹은 지나친 복용으로 인해 내성이 생기는 경우가 있다. 내성균이 한번 생겨나면 그 내성균은 다른 균에도 내성을 전이시켜 내성균이 계속 늘어나게 하기 때문에 결국에는 항균 능력이 더 강한 항생제 혹은 다른 계열의 항생제로 바꾸어 사용해야 한다. 그렇기에 병원성 세균들이 내성을 가지지 않는 새로운 항생 물질을 발견하는 것은 실로 매우 중요하다.
이에 본 연구에서는 대나무 종 Sasa borealis의 잎에서 항균 작용을 하는 박테리오신을 생성하는 유산균을 분리하고, 생성되는 박테리오신의 항균 활성을 알아보았다. 또한 이렇게 분리된 유산균의 probiotic한 기능을 살펴보고자 분변에서 추출한 bacterial 16S rRNA 유전자의 염기서열 분석을 통한 intestinal microbiome 분포의 변화를 분석하였다.
대나무는 전 세계적으로 92개의 속과 1400여 종이 존재한다. 우리나라에도 4속 14종의 대나무가 자라고 있다. 이 중 왕대, 오죽, 조릿대 (Sasa borealis) 등 몇 가지 종만이 사람들에게 알려져 있다. 가장 흔하게 볼 수 있는 대나무는 조릿대인데, 성인병에 효능이 있다고 알려져 있기는 하지만 그러한 사실에 대한 의학적 연구는 아직 진행이 미미한 상태이다. 한방에서도 대나무가 약으로 쓰여 온 경우는 있지만, 그 잎을 약재로 쓰지는 않았다. 본 실험에서는 조릿대 (Sasa borealis)를 재료로 사용하는데, 구매한 조릿대 잎은 잘 말려서 잘게 썰어 놓은 것으로 유산균과 박테리오신을 분리/분석하기에 적합하였다.
박테리오신은 미생물에 대한 경쟁적인 생육 저해제로서 펩 타이드 또는 단백질로 구성된 항균성 물질이다. 보통 치즈 및 유제품 또는 발효 식품 등에서 분리한 다양한 미생물로부터 생산된다고 알려져 있으며 특히 유산균은 다양한 항균물질 (박테리오신) 을 생산하는 것으로 알려져 있다. 위와 같은 박테리오신의 정의는 예외적인 박테리오신들이 추후 무수히 분리, 보고되면서 Konisky (1982) 에 의해 단백질계 물질이며, 생산하는 모균주가 이에 의해 사멸되지 않는 물질이라고 다시 한번 정의되었다. 또한 박테리오신의 분자 및 생리학적 특성에 따라 크게 4개의 군 (Class) 로 나누어 분류하였는데, Class I은 lantibiotics로 유전자가 단백질로 translation 된 이후의 변이에 의해 생성되는 아미노산인 lantionine과 β-methyllantionine을 함유하는 박테리오신 이며, Class II는 지금까지 분리/보고된 많은 박테리오신이 속하는 군으로써 lantionine을 함유하지 않는 박테리오신으로 비교적 분자량이 작고 작은 분자량으로 인해 열에 안정적인 특징을 지닌다. Class III의 경우 분자량이 30kDa 이상으로 크며 Class IV박테리오신은 분류에 있어 재검토가 필요한 군으로 분류 되어있다.
실험을 통해 댓잎 추출물에서 총 11가지의 유산균 isolate들을 분리할 수 있었는데, 그 중 M8 isolate만이 강한 항균능을 보이는 것을 확인할 수가 있었다. 억제환 생성을 살펴보았더니, 테스트한 그람 양성균과 음성균 모두에 대하여 성장 억제 효과를 보였다. 반면, 전혀 영향을 받지 않는 미생물들이 있다는 것을 볼 수 있었는데, 알고 보니 이들은 모두 같은 유산균 (genus Lactobacillus)에 해당하는 것이었다. 어떤 경우에라도 유산균들이 억제되지 아니하고 다른 불필요한 미생물들의 성장만 억제된다면, 이와 같은 물질을 유산균의 효능을 극대화 시키는 등의 용도에 활용할 수 있을 것이라 판단하였다.
분리주의 분자계통학적 동정을 통해 항균능을 보이는 박테리오신을 생성하는 유산균이 Lactobacillus pentosus M8으로 밝혀졌다. Lactobacillus pentosus M8에 의해 생성되는 박테리오신을 정제하기위해 XAD-1180 레진을 이용한 컬럼을 사용하였다. 1차적으로 염과 불순물이 제거된 bacteriocin은 그 항균능이 80% acetonitrile로 elution 된 fraction에서만 나타났으며, 추가적인 정제를 위해 Vivaspin MWCO 컬럼으로 분자량별 활성능을 살펴보았다. 그 결과 50-100kDa 의 분자량을 가진 bacteriocin이 유일하게 항균능을 지닌 것으로 확인되었다. 보다 확실한 정제를 위해 RP-HPLC를 통해 80% acetonitrile로 elution 하였을 때 single peak 를 관찰할 수 있었고, 이 active한 fraction으로 최종 항균능을 평가, 확인할 수 있었다. 전기영동과 silver staining을 통해, Lactobacillus pentosus M8이 생성한 박테리오신은 약 66kDa의 분자량을 가진 것으로 확인되었다. 분자량으로는 Class III에 속하는 박테리오신이라 할 수 있었지만, 여느 다른 Class III 박테리오신과는 다르게 열과 pH에 안정적인 특성도 확인할 수 있었다.
위의 과정으로 정제된 박테리오신의 작용 기작을 살펴본 결과, 세포막의 붕괴/분열이 확인되었으며, 이는 Transmission Electron Microscope (TEM) 이미지를 통해 육안으로도 확인이 가능했다. 따라서 상대 균주의 세포막에 이러한 hydrophobic molecules이 작용하여 그 생리적 기능을 파괴함으로서, 세포의 에너지 대사와 물질의 이동을 저해하여 이루어진다고 결론 지을수 있었다.
세균뿐만 아니라, Lactobacillus pentosus M8이 면역 세포에는 어떤 영향을 끼치는지도 본 연구를 통해 알아보았다. 그 결과, normal cell에 해당하는 murine splenocyte나 macrophage cell line들에는 cytotoxicity를 보이지 않음을 확인 할 수 있었다.
대나무 종 Sasa borealis잎 추출물에서 분리해낸 유산균인 Lactobacillus pentosus M8의 probiotic한 기능을 살펴보기 위해 생쥐 분변에서 추출한 bacterial 16S rRNA 유전자의 염기서열 분석을 통한 intestinal microbiome 분포의 변화를 관찰, 분석한 결과, STD나 HFD만 제공한 그룹에 비해 유산균 (Lactobacillus pentosus M8, Lactobacillus paraplantarum GL, Lactobacillus casei LS2) 을 함께 경구 투여한 그룹에서 sequence수가 더 많았다. HFD만을 제공받은 그룹은 STD를 제공받은 그룹에 비해 fecal microbiome에서 Bacteroidetes의 수는 감소하였고 Firmicutes의 수는 증가하였다. 반면 유산균을 경구 투여한 그룹은 HFD만 제공받은 그룹에 비해 Bacteroidetes는 크게 증가하였으며 Firmicutes는 감소하였다. 따라서 HFD만 제공받은 그룹은 fecal microbiome에서 Bacteroidetes에 대한 Firmicutes의 비율이 가장 높았고, 유산균을 투여한 세 그룹의 비율은 STD만 먹인 그룹보다도 낮았으며, Lactobacillus pentosus M8을 경구 투여한 그룹에서 가장 두드러졌다. HFD에 의해 유도된 비만의 결과, 장내 세균총 중 Bacteroidetes는 감소하고 Fermicutes는 증가한다고 밝혀져 있는데 (Ley RE et al, 2006), 댓잎추출물에서 분리된 Lactobacillus pentosus M8의 probiotic으로써의 능력으로 인해 비만에 의한 fecal microbiome 분포의 변화를 정상상태로 회복시킨다는 사실을 확인하였다.

목차 (Table of Contents)

• INTRODUCTION 1
• 1. Antibiotics 2
• 1.1. Type of antibiotics 3
• 1.1.1. Quinolones 3
• 1.1.2. βeta-lactams 3
• 1.1.3. Aminoglycosides 4
• 2. Bamboo 5
• 2.1. Uses 5
• 2.1.1. Medical uses 6
• 2.2. Bamboo species 7
• 2.2.1. Sasa borealis (Hack.) Makino & Shibata 7
• 2.3. Effectiveness of Sasa borealis 7
• 3. Bacteriocin 9
• 3.1. Classification of bacteriocin 9
• 3.1.1. Class I bacteriocin 9
• 3.1.2. Class II bacteriocin 10
• 3.1.3. Class III bacteriocin 10
• 3.1.4. Class IV bacteriocin 10
• 3.2. Medical significance of bacteriocin 11
• 4. Lactic Acid Bacteria (LAB) 12
• 4.1. Probiotics 12
• 4.2. Effectiveness of Lactic acid bacteria 13
• 4.3. Lactobacillus pentosus 14
• 5. Sequencing 15
• 5.1. Sanger sequencing 15
• 5.2. Pyrosequencing 16
• 5.2.1. Use of pyrosequencing 18
• 5.2.2. Disadvantage of using pyrosequencing 19
• 6. Aims of this study 20
• MATERIALS AND METHODS 21
• 1. Isolation and Identification of Lactic Acid Bacteria from Sasa borealis leaf extract 22
• 1.1. Sasa borealis leaf extract 22
• 1.2. Bradford assay 22
• 1.3. Anthrone test 23
• 1.4. Quantitative analysis of compounds of Sasa borealis by HPLC 23
• 1.5. Antimicrobial activity of Sasa borealis leaf extract 24
• 1.5.1. Measuring Optical Density (O.D.) of bacterial strains 24
• 1.5.2. Time-Kill assay 25
• 1.6. Sampling and cultivation of Lactic Acid Bacteria (LAB) 25
• 1.6.1. Counting Colony Forming Unit (CFU) of LAB 25
• 1.6.2. Mann, Rogosa and Sharpe (MRS) agar for LAB cultivation 26
• 1.6.3. Mann, Rogosa and Sharpe (MRS) broth for LAB cultivation 27
• 1.7. Identification of isolated Lactic Acid Bacteria 28
• 1.7.1. Antimicrobial activity of isolated Lactic acid bacteria 28
• 1.7.2. Isolation of bacteriocin producing Lactic Acid Bacteria 29
• 1.7.3. Phylogenetic analysis of bacteriocin producing Lactic Acid Bacteria 29
• 1.8. Growth curve and production of bacteriocin 30
• 2. Purification and antimicrobial activity of bacteriocin 30
• 2.1. Bacterial strains and media 30
• 2.1.1. PBS (Phosphate buffered saline) 31
• 2.1.2. Trypticasein soy agar (TSA) 31
• 2.1.3. Brain heart infusion (BHI) 32
• 2.2. Purification of the bacteriocin 32
• 2.2.1. Resin and column preparation 33
• 2.3. Antimicrobial activity of purified bacteriocin 34
• 2.4. Minimum inhibitory concentration of the bacteriocin 34
• 2.5. Stability of the bacteriocin (Temp., pH, enzyme test) 35
• 2.6. Molecular weight estimation of bacteriocin (SDS-PAGE) 35
• 2.6.1. Silver Staining 36
• 3. Mode of Action of bacteriocin 37
• 3.1. Membrane permeability assay 37
• 3.2. Transmission Electron Microscope (TEM) 37
• 4. Cell viability and measurement of anti-inflammatory effect of LAB 38
• 4.1. Cell cytotoxicity assay 38
• 4.1.1. Lactic Acid Bacteria preparation 39
• 4.2. Nitric Oxide (NO) assay 39
• 5. Cell culture and media 40
• 5.1. Cell lines 40
• 5.1.1. HBSS (Hank’s Balanced Salt Solution, pH7.2) 40
• 6. Analysis of alteration in fecal microbiome community 41
• 6.1. Experimental animal 41
• 6.1.1. In vivo experiment design 41
• 6.1.2. Composition of the standard diet 42
• 6.2. Genomic DNA extraction from mouse fecal sample 42
• 6.3. Polymerase Chain Reaction (PCR) 42
• 6.3.1. 10X TAE buffer 44
• 6.3.2. TE buffer 44
• 6.3.3. 5X Native sample loading buffer 44
• 6.4. Preparation of samples for sequencing 45
• 6.4.1. Barcode tagging PCR 45
• 6.4.2. Purification and quantification 46
• 6.4.3. Whole process of pyrosequencing 47
• Results 48
• 1. Preparation of Sasa borealis leaf extract 49
• 1.1. Partial purification of active compounds of Sasa borealis 49
• 1.2. Protein and carbohydrate contents of Sasa borealis 49
• 2. Analysis of Sasa borealis (Hack.) Makino & Shibata 52
• 2.1. Analysis of compounds in Sasa borealis 52
• 3. Antimicrobial effect of Sasa borealis leaf extract 57
• 3.1. Antimicrobial effect of Sasa borealis (diffussion method) 57
• 3.2. Measurement of Optical Density (O.D.) 57
• 3.3. Antimicrobial activity of leaves and sprouts 58
• 3.4. Time-kill assay 62
• 4. Isolation and identification of LAB 64
• 4.1. Sampling and identification of Lactic acid bacteria 64
• 4.2. Antimicrobial activity of Lactic acid bacteria isolates 67
• 4.2.1. Morphological identification of isolates M8 and M13 67
• 4.3. Phylogenetic analysis of bacteriocin producing Lactic Acid Bacteria 71
• 4.4. Growth curve and production of bacteriocin 73
• 5. Purification and antimicrobial activity of bacteriocin 75
• 5.1. Purification and antimicrobial activity of the bacteriocin 75
• 5.2. RP-HPLC purification 79
• 5.3. Minimum inhibitory concentration (MIC) of the purified bacteriocin 81
• 5.4. Stability of the bacteriocin 84
• 5.5. Molecular weight estimation of bacteriocin (SDS-PAGE) 86
• 6. Mode of action of bacteriocin 88
• 6.1. Membrane permeability assay 88
• 6.2. Transmission Electron Microscope (TEM) 88
• 7. Immuno-modulatory effects of Lactobacillus pentosus M8 92
• 7.1. Cell cytotoxicity 92
• 7.2. Nitric oxide (NO) determination 92
• 8. Genomic DNA isolation from fecal samples 95
• 9. Lactobacillus pentosus M8 on fecal microbiome 97
• DISCUSSION 103
• REFERNCES 107
• ABSTRACT IN KOREAN 115