Identification and characterization of B7-H3 in hepatocellular carcinoma using monoclonal antibody = 단일클론 항체를 이용한 간암에서의 B7-H3 동정 및 기능 연구

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

B7-H3 (also known as CD276) is an immune checkpoint molecule in the B7 ligand family. B7-H3 protein expresses in many different types of tumor tissues including hepatocellular carcinoma but has a limited expression at a low level in normal tissues. Previously, we generated a panel of monoclonal antibodies (mAbs) against surface molecules on human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we found that NPB40, one of mAbs, recognizes B7-H3 in HCC cells. To explore the role of B7-H3 on HCC cells, B7-H3 was depleted in HCC cells by siRNAs, or B7-H3High and B7-H3Low HCC cells were sorted by NPB40. B7-H3 depletion caused decreased cell survival, adhesion, and proliferation and induced apoptosis, suggesting that B7-H3 promotes cell survival, adhesion, and proliferation in HCC cells. Cell sorting also proved that B7-H3High HCC cells have higher clonogenic survivability than B7-H3Low HCC cells. Moreover, B7-H3 depletion downregulated the expression of immune checkpoint molecules in HCC cells, suggesting that B7-H3 plays a critical role in the immune evasion of HCC cells. Overall, these findings indicate that B7-H3 is an attractive target for cancer immunotherapy and suggest that NPB40 is a promising candidate for further therapeutic development.

국문 초록 (Abstract)

B7 family 중 하나인 B7-H3 (CD276)는 항면역요법의 새로운 타겟으로 떠오르고 있다. B7-H3는 단백질 수준에서 간암을 포함한 여러 암 조직에서 높게 발현하면서도 B7 리간드 군의 B7-H3 (CD276)는 암 면역 요법의 새로운 타겟으로 떠오르고 있다. B7-H3는 단백질 수준에서 간암을 포함한 많은 다른 종류의 암 조직에서 높게 발현되지만 정상 조직에서는 낮은 수준으로 발현한다. 기존에 인간 만능줄기세포의 표면 분자에 대한 단일클론 항체 패널을 생산하였는데, 본 연구에서는 그 중 하나인 NPB40이 간암 세포에서 B7-H3를 인식한다는 것을 발견하였다. 간암 세포에서 B7-H3의 역할을 탐구하기 위해, siRNA를 사용해 간암 세포에서 B7-H3의 발현을 억제하거나 NPB40 항체를 이용해 B7-H3의 세포 표면 발현 정도에 따라 간암 세포를 B7-H3High와 B7-H3 Low 로 분리하였다. B7-H3의 발현 억제는 간암 세포의 세포 생존율, 결합력, 성장이 저해를 유발하였다. NPB40을 이용한 세포를 분리는 B7-H3의 발현이 높은 세포가 발현이 낮은 세포에 비해 더 높은 복제 생존성을 가지고 있다는 것을 증명했다. 또한, B7-H3 발현 억제는 간암 세포에서 CD24와 CD47의 발현을 규제하였으며, 이는 B7-H3가 간암 세포의 면역 회피에 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다. 따라서, 이러한 결과는 B7-H3가 암 면역 요법에 적합한 타겟임을 나타내며, 치료제로서 NPB40의 연구 개발 가치를 입증한다

목차 (Table of Contents)

• INTRODUCTION 1
• MATERIALS AND METHODS 4
• 1. Cell culture 4
• 2. Purification of monoclonal antibodies 4
• 3. Flow cytometry and antibody internalization assay 5
• 4. Immunocytochemistry 6
• 5. Cell surface biotinylation, immunoprecipitation (IP), and Western blotting 7
• 6. Mass spectrometry 8
• 7. Cell growth inhibition assay 8
• 8. Wound-healing assay 9
• 9. Cell adhesion assay 9
• 10. Antibody biotinylation and Cell isolation 9
• 11. Transfection 10
• 12. Clonogenic assay 10
• 13. Apoptosis assay 11
• Results 12
• 1. NPB40 binds to various cancer cells but not on PBMCs 12
• 2. NPB40 recognizes B7-H3 expressed on the cell surface 17
• 3. NPB40 internalizes into HCC and PC cells 21
• 4. B7-H3 enhances cell survival and adhesion 24
• 5. B7-H3 suppresses apoptosis of HCC cells 29
• 6. B7-H3 supports co-expression of ICP molecules in HCC cells 32
• DISCUSSTION 35
• REFERENCES37
• 국문초록 41