Interaction of interspecies : cutibacterium and staphylococcus species on the skin microbiome

국문 초록 (Abstract)

피부는 외부 침입자로부터 우리를 보호하는 첫 번째 방어 기작이며, 다양한 미생물이 서식하는 곳이다. 지성 피부에는 Cutibacterium 이, 피부의 습한 부위에는 Staphylococcus 와 Corynebacterium 이 우점하고있다. 이와 같이, 피부에서의 미생물 군집 및 구성은 많이 연구되었지만, 피부 미생물의 종간 상호 작용은 연구가 거의 이루어지지 않았다. 이 연구에서 우리는 (i) 사람의 피부에서 분리된 Cutibacterium 과 Staphylococcus 와의 상호 작용을 확인하고 (ii) MinION 장치로 진행한 유전체 시퀀싱을 통해 상호 작용과 관련된 유전자를 발굴할 것이다. Staphylococcus 와 Cutibacterium 의 분리 및 동정을 위해 각각 23명과 28명의 피험자를 모집했다. 면봉과 코팩을 이용하여 샘플을 수집했으며, Tryptic Soy agar, Mannitol salt agar 및 Brucella Anaerobic agar를 배양 배지로 사용했다. Staphylococcus aureus 와 Cutibacterium 및 Staphylococcus 와의 상호 작용을 확인하기 위해 pCM29를 삽입한 S. aureus USA300을 사용했으며, 분리 동정된 균주들과 4시간동안 공동배양을 진행했다. 초기 샘플들의 광학 밀도는 0.1 로 설정했으며, S. aureus USA300의 형광 발현 정도는 InVivo Smart-LF 장치를 사용하여 검출하였다. 유전체 시퀀싱은 MinION 장치를 이용하여 분석을 수행하였고, 그 결과로 상호 작용과 관련된 유전자를 발굴했다. 피부에서 총 198 개의 Staphylococcus 와 125 개의 Cutibacterium 을 분리하였고, 시퀀스가 서로 겹치지 않는 50 개의 Staphylococcus 와 40 개의 Cutibacterium 을 선정하여 피부 pH에 따른 피부 미생물들간의 종간 상호작용을 알아보았다. 두 가지 종의 공동 배양을 통해 우리는 19 개와 10 개의 Staphylococcus 샘플과, 2 개 및 8 개의 Cutibacterium 샘플이 S. aureus 의 형광 발현 정도를 감소시키는 것을 확인하였고 (감소 그룹), 6 개와 2 개의 Staphylococcus 샘플과 7 개 및 5 개의 Cutibacterium 샘플이 S. aureus의 형광 발현 정도를 증가 시켰음을 확인했다 (증가 그룹). pH 7.2 의 Columbia 배지에서 S. aurues 와 Cutibacterium 을 공동 배양 했을 때, 증가 그룹에서만 5개의 유전자를 발굴하였고, pH 4.5 의 Columbia 배지에서 S. aurues 와 Staphylococcus 샘플을 공동 배양한 경우는 증가 그룹과 감소 그룹에서 각각 6 개의 유전자를 발굴하였다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The skin is the first line of defense against foreign invaders and is home to diverse microorganisms. The sebaceous sites of the skin are dominated by Cutibacterium, and in the moist areas, Staphylococcus and Corynebacterium were abundant. Although the microorganism compositions of every skin site were well-studied, the interspecies interactions of the skin microorganisms were poorly understood. In this study, we identify (i) the interactions of Staphylococcus aureus with Cutibacterium and Staphylococcus species isolated from the skin and find out (ii) the pathways or genes related to the interactions by Nanopore MinION sequencing. A total of 23 and 28 subjects were recruited for isolation of Staphylococcus and Cutibacterium, respectively. Samples were collected with cotton swabs and nose strips. Tryptic Soy agar, Mannitol salt agar and Brucella Anaerobic agar were used as culture media. To identify the interactions of Staphylococcus aureus with Cutibacterium and Staphylococcus, we use S. aureus USA300 containing pCM29 and co-culture with isolates for 4 h. At 0 h, the optical density (OD) of samples was 0.1, and fluorescence intensities of S. aureus were detected using InVivo Smart-LF device. Genome sequencing was performed using MinION device with Nanopore technology to identify the pathways and genes related to the interactions. A total of 198 Staphylococcus and 125 Cutibacterium were isolated from the skin, and 50 Staphylococcus and 40 Cutibacterium were selected to find out the interactions on the skin of acne patients and healthy individuals. Through intergenera and interspecies co-culture, we find out the 19 and 10 Staphylococcus, 2 and 8 Cutibacterium isolates decreased (Descending group) and 6 and 2 Staphylococcus, 7 and 5 Cutibacterium isolates increased (Ascending group) the fluorescence intensities of S. aureus at two kinds of skin pH environment. In Cutibacterium samples, only 5 genes were identified in the Ascending group at pH 7.2 and in Staphylococcus samples, every 6 genes were identified in the Ascending group and Descending group at pH 4.5, respectively.

목차 (Table of Contents)

• 1. Introduction 1
• 1.1 Importance of Interspecies Interactions in Skin Microorganisms 1
• 1.2 Concentration of Hydrogen Ions on the Skin 2
• 1.3 Oxford Nanopore MinION Sequencing 3
• 1.4 Purpose of this study 4
• 2. Materials and Methods 5
• 2.1 Subjects Recruitment and Samples Collection 5
• 2.2 Isolation and Identification of Staphylococcus and Cutibacterium 6
• 2.3 Preparation of Samples for Interspecies Co-culture 7
• 2.4 Screening of Interactions between S. aureus Containing pCM29 and Isolates 8
• 2.5 Preparation of Genomic DNA and Library Preparation of Genome Sequencing 10
• 2.6 Genome Sequencing and Analysis 11
• 3. Results 12
• 3.1 Isolation of Staphylococcus and Cutibacterium from Acne Patients and Healthy Individuals 12
• 3.2 Fluorescence Intensities Were Lower at pH 4.5 Columbia Broth than pH 7.2 Environment 18
• 3.3 Ascending or Descending Interactions Were Identified through Co-culturing S. aureus Containing pCM29 with Isolates 25
• 3.4 Genome Sequencing of Staphylococcus and Cutibacterium Isolates by Nanopore Technology 30
• 3.5 Identification of Genes and Pathways Related to the Interactions 34
• 4. Discussion 40
• 5. References 42
• 6. 국문초록 47