Structural and Functional Analysis of Human Heat Shock Factor 1 in Redox Regulation

국문 초록 (Abstract)

Heat shock response는 세포가 열 충격, 활성산소 및 산화 스트레스, 중금속 오염, 아미노산 유도체 등 스트레스 조건에 노출되었을 때 이들로부터 우리 몸을 보호하기 위한 수단으로 작용한다. Heat shock response시에는 대부분의 단백질 발현은 중단하는 반면 heat shock proteins (HSPs)의 발현을 증가시킴으로서 스트레스에 의한 피해를 최소화한다. 발현이 증가하는 heat shock protein은 단백질의 folding 및 assembly 과정을 조절하는 molecular chaperone으로 작용할 뿐만 아니라, 활성산소 및 산화스트레스에 의한 apoptosis 및 손상에 억제 효과를 보이는 endogenous inhibitor of apoptosis (EIA)로 작용한다. 세포질에 존재하고 있던 HSF1은 스트레스에 의하여 활성화된 후, HSF1은 핵으로 이동해 HSP 유전자 promoter의 HSE (heat shock element)에 결합하여 HSPs의 발현을 촉진한다.
주변 환경의 redox state에 따라 nitrosylation되거나 disulfide bond를 형성함으로써 단백질의 구조와 기능에 영향을 미치는 cysteine 잔기는 hHSF1 sequence상에 5군데에서 발견된다. 이상과 같이 redox 변화는 hHSF1 활성에 영향을 미칠 것으로 생각되나, 그 구체적인 작용 기작이 명확하지 않을 뿐만 아니라, 아직까지 redox state에 따른 hHSF1 구조변화가 정확히 밝혀져 있지 않다. 이를 알아보기 위하여 wild-type hHSF1과 C1, C2, C3 mutant hHSF1들의 redox 변화에 따른 trimerization 과 DNA binding activity와의 상관관계에 관하여 알아보았다. 예비실험에서 full sequence wild-type hHSF1과 C1, C2, C3 mutant들은 redox에 따라 trimer 형성은 모두 잘 되었다. 그러나 wild-type hHSF1과 C3 mutant는 DNA binding activity가 있는 반면 C1과 C2 mutant들은 DNA binding activity가 나타나지 않았다. 이것은 C1과 C2가 DNA binding에 관여하고 있다는 의문을 제시하였다. 그래서 DNA binding domain만을 expression시켜서 그들의 trimerization과 DNA binding activity의 연관성을 알아보았다. wild-type DNA binding domain과 C2 mutant DNA binding domain의 경우 DNA binding activity는 있었으나 redox의 영향은 받지 않았다. 또한 이것의 trimerization은 관찰 되었다. 이와 같은 결과로 미루어 보아 trimerization과 DNA binding activity는 연관성이 전혀 없으며 그 이유는 wild-type hHSF1내의 DNA binding domain이 정상적인 상태에서는 C1혹은 C2가 C4 혹은 C5와 disulfide 결합을 통하여 wild-type hHSF1의 내부에 존재하게 됨으로 DNA binding을 할 수 없는 구조가 되고 trimerization을 통하여 hHSF1의 DNA binding domain이 밖으로 노출되게 되어 HSE와 binding 하기 때문일 것으로 사료된다. 따라서 DNA binding domain만의 경우 항상 노출된 상태임으로 redox 영향을 받지 않고도 항상 DNA에 결합할 수 있다. 앞으로 더 많은 구조 관찰실험이 요구되어지지만 C4, C5 mutant hHSF1의 경우 HSE와 결합하기 쉬운 형태로 DNA binding domain이 노출되기 때문에 hHSF1의 DNA binding activity가 redox에 영향을 받지 않고 항상 일정한 DNA 결합력을 가질 것으로 사료된다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. INTRODUCTION------------------------------------3
• Ⅱ. MATERIALS AND METHODS------------------------12
• 1. Preparation Recombinant DNA------------------------12
• 1-1. Preparation of wild-type hHSF1 ------------------12
• 1-2. Site-directed mutagenesis of hHSF1-----------------13
• 1-3. Preparation of wild-type DNA-binding domain of hHSF1----------------------------------------14
• 1-4. Site-directed mutagenesis of DNA-binding domain
• of hHSF1--------------------------------------15
• 2. Expression and Purification GST fusion proteins and 6 × His
• -tagged proteins-----------------------------------16
• 2-1. Expression of wild-type hHSF1 and mutants---------16
• 2-2. Expression of wild-type hHSF1's DNA-binding domain
• and mutants------------------------------------16
• 2-3. Purification of GST fusion proteins-----------------17
• 2-4. Purification of 6 × His-tagged proteins------------17
• 3. In vitro trimerization of hHSF1, hHSF1's DNA-binding
• domain and their mutants with immunoblotting-----------18
• 4. Electrophoretic mobility gel shift assay of hHSF1,
• hHSF1's DNA-binding domain and their mutants----------19
• Ⅲ. RESULTS ---------------------------------------20
• 1. Preparation of proteins-----------------------------20
• 1-1. Expression and purification of wild-type hHSF1-------20
• 1-2. Expression and purification of mutants hHSF1--------21
• 1-3. Purification of wild-type hHSF1's DNA-binding domain-23
• 1-4. Purification of hHSF1's DNA-binding domain mutants--24
• 2. Trimerization of hHSF1, DNA-binding domain
• and their mutants----------------------------------26
• 2-1. In vitro trimerization of wild-type hHSF1 occurs by
• redox regulation---------------------------------26
• 2-2. In vitro trimerization of hHSF1 is not affected by the
• deletion of cysteine residue-----------------------28
• 2-3. In vitro trimeriazation of wild-type hHSF1's DNA
• -binding domain by redox regulation----------------30
• 2-4. In vitro trimerization of hHSF1's DNA-binding domain is
• not affected by the deletion of cysteine residue-------33
• 3. DNA-binding activity of hHSF1, hHSF1's DNA-binding
• domain and their mutants through redox regulation-------37
• 3-1. HSE-binding activity of wild-type hHSF1 and mutants--37
• 3-2. HSE-binding activity of wild-type hHSF1's DNA
• binding domain didn't regulate by redox--------------42
• Ⅳ. DISCUSSION-----------------------------------45
• Ⅴ. REFERENCES----------------------------------48
• Ⅵ. ABSTRACT ( in Korean )--------------------53