안점막자극 대체시험법 개발을 위한 인체각막모델 연구 = Study on development for the alternative methods for in vitro eye irritation test with reconstituted human corneal epithelium

국문 초록 (Abstract)

안자극이란 의약품 및 화장품 등의 화학물질에 대한 노출 후, 안구에서 자극성이 나타나는 것으로 정의된다(OECD, 2002). 기존의 안자극시험은 Draize eye irritation test (OECD TG 405)로 토끼의 눈에 시료물질을 투여한 후 안구손상 반응 정도를 점수화하여 자극성을 판별하는 시험방법이다. 이는 많은 수의 토끼가 희생되어야 하며 동물에게 많은 고통을 주므로 동물 복지를 위해서 다양한 동물대체시험법이 제시되었다. 안자극시험의 동물대체시험법으로는 현재 BCOP (bovine corneal opacity and permeability)시험법이 OECD TG 437로 등재되어 있지만 눈에 부식성이 있거나 자극이 심한 물질 (GHS 1)인 경우 만을 판별할 뿐, GHS 2A/2B와 같은 저자극 물질은 판별하지 못하는 단점이 있다. 또한 이종의 유기조직을 사용함으로써 실제 인간에서 보이는 반응과의 유사성 여부에 대한 문제점이 제기되고 있어 저자극 물질을 판별하고, 인간과의 이종성 문제가 없는 대체시험법 연구가 필요한 실정이다. 이러한 연구의 필요성에 따라 본 연구에서는 안자극시험의 다른 대체시험법으로 사람의 각막세포를 3차원적으로 재구성한 인체각막모델을 이용한 대체시험법을 연구하였다. 본 연구는 안자극 대체시험법으로 개발 진행 중인 인체각막모델 중에서 국외 2종, 국내2종의 모델을 선정하여 alcohols, surfactants, esters를 포함하는 다양한 GHS class의 시험물질들의 안자극시험을 수행하였다. 고자극, 저자극 물질을 모두 포함하는 6종의 액체 시험물질과 4종의 고체 시험물질을 시험하였다. 액체 시험물질은 DPBS(negative control), 2% SDS (positive control), 5% benzalkonium chloride (GHS 1), 2-ethyl-1-hexanol (GHS 2A), 1% sodium hydroxide (GHS 2B), glycerol (GHS NC)이며, 고체 시험물질은 promethazine hydrochloride (GHS 1), dibenzyl phosphate (GHS 2A), ammonium nitrate (GHS 2B), potassium tetrafluoroborate (GHS NC)로 다양한 자극물질의 안자극시험을 수행하여 모델별 안자극 예측력을 평가하였다. 추가로 모델별 인체각막모델의 형태학적 특성을 비교 분석하기 위해 면역조직학적 연구를 수행하였으며, 음성대조물질의 흡광값, ET-50, IC-50, TEER를 측정하여 모델별 인체각막 모델의 방어기능적 특성을 평가하였다. 이와 더불어, 각 모델별 안자극시험 수행을 위한 안자극시험 비교 자료집과 안자극시험 수행에 필요한 안자극 시험물질 자료집을 마련하였다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Eye irritation is generally defined within the regulatory context as the production of changes in the eye following the application of a test substance to the anterior surface of the eye (OECD, 2002). The conventional test for the eye irritant and severe irritant potential of chemicals is the rabbit eye test and which has become the international standard assay for acute ocular toxicity (OECD TG405). To reduce and/or replace the Draize rabbit eye test with in vitro test methods, many efforts are being made to develop new alternative in vitro test methods for eye irritation tests, i.e., the Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) assay, which was accepted by regulatory bodies for the identification of corrosive and severe ocular irritants (GHS 1). However, there is no in vitro test which is currently accepted for discriminating of ocular irritants (GHS 2) and non-irritants (GHS NC). Therefore, human reconstructed tissue models have been suggested for incorporation into a tiered testing strategy to ultimately replace the Draize rabbit eye irritation test (OECD TG405). In this study, we tested four human corneal epithelial models as a new alternative in vitro eye irritation test method. Ten chemicals including alcohols, surfactants, and esters were selected with all of the GHS Categories. Six liquids, i.e., DPBS (negative control), 2% SDS (positive control), 5% benzalkonium chloride (GHS 1), 2-ethyl-1-hexanol (GHS 2A), 1% sodium hydroxide (GHS 2B), glycerol (GHS NC), and four solids, i.e., promethazine hydrochloride (GHS 1), dibenzyl phosphate (GHS 2A), ammonium nitrate (GHS 2B), potassium tetrafluoroborate (GHS NC) were selected so that both exposure regimens could be assessed of chemical classes. As a results, eye irritancy of each chemicals was well defined by using reconstructed human corneal epithelial models, according to their GHS categories. Moreover, the barrier function was well preserved as measured by high transepithelial electrical resistance and ET50.