Molecular cloning and site-directed mutagenesis of an extracellular protease gene from Vibrio vulnificus = Vibrio vulnificus에서 분비되는 단백질분해효소 유전자의 클로닝 및 위치 지정 돌연변이 유도

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Bacterial secreted proteases have important physiological roles in the regulation of bacterial life cycle. The proteases secreted from pathogenic microorganisms can also act as toxic factors against the host. Many of these proteases are metalloproteases having a zinc(II) ion in their catalytic site. The zinc metalloproteases produced by pathogenic bacteria show a wide variety of pathological properties. For example, a zinc metalloprotease produced by Vibrio vulnificus (V. vulnificus), which is an opportunistic pathogen, can enhance vascular permeability and causes tissue damage through degradation of a wide variety of host proteins. In this laboratory a broad specificity metalloprotease referred to as vEP has been purified previously from the culture supernatant of V. vulnificus ATCC 29307 and characterized with respect to prothrombin activation and fibrinolytic activity. Based on the sequence of vEP gene, the entire coding region was obtained by polymerase chain reaction (PCR), cloned into a periplasmic-directed expression vector (pFLAG-ATS), and expressed in Escherichia coli (E. coli). The active recombinant vEP (named rvEP) was purified from the periplasmic proteins of the transformant E. coli cells. The purified rvEP enzyme appeared both as 45- and 35-kDa forms on SDS-polyacrylamide gel. It has been shown that the intact 45-kDa protease can be autoprocessed to make 35-kDa in size by the removal of its C-terminal region. The purified enzyme was characterized with respect to the effects of temperature, pH-dependence, substrate specificity and inhibitors on enzyme activity. Two mutants proteases designated as △C100 and G202D were constructed and their properties were studied by comparing with those of at the wild type vEP enzyme. One mutant protease △C100, which had a deletion of the C-terminal 100 amino acids from vEP showed reduced specific activity at the level of 80%, compared to that of wild type enzyme. Another mutant protease G202D that has a substitution of glycine202 to aspartate200 exhibited approximately 58% level of specific activity, compared that of wild type enzyme. Previous data obtained in this laboratory have shown that vEP can activate prothrombin and hydrolyze fibrin as well as cross-linked fibrin by proteolysis. The activity of the two mutants on prothrombin activation and fibrin hydrolysis was also investigated in this study. The data obtained showed that △C100 and G202D proteases could also activate prothrombin to have actual thrombin activity at the levels of 58% and 33.1%, respectively, compared that of wild type vEP. The mutants also showed lesser fibrinolytic activity than wild type enzyme. The mutant protease G202D was less thermal stable than wild-type with △C100 showing no change in thermal stability. There were noticeable differences in substrate specificity between wild type and △C100 enzymes, as shown by both the extent of cleavage of protein substrates and the pattern of cleavage, especially with the cleavage of γ-globulin whereby △C100 exhibited markedly decreased proteolysis. All three enzymes had similar sensitivity towards metal chelator-type inhibitors, but △C100 was less sensitive than wild-type vEP to inhibition by Ni2+ while G202D was more sensitive than wild-type vEP to inhibition by Cu2+. Taken together, the data obtained in this study show that the C-terminal domain of vEP may play a role in the binding of certain substrate proteins to enable better cleavage. However, it does not appear to be involved in the processing of the propeptide of the enzyme during maturation process. The change in thermal stability of G202D shows that Gly202 may play a role in the stabilization of the enzyme at high temperature.

국문 초록 (Abstract)

세균으로부터 분비되는 단백질 분해효소들는 세균의 생활주기에서 생리학적으로 중요한 역할을 할 뿐만 아니라 숙주세포에 독성을 발휘하여 여러 가지 질병을 유발하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서 사용한 Vibrio vulnificus(V. vulnificus) ATCC 29307 균주에서 분비되는 metalloprotease(vEP라 명명됨)는 Zn²+ 이온을 함유하고 있으며, 혈액응고에 관여하는 다양한 혈장 단백질을 분해하여 세균이 혈관에 침투하는 것을 용이하게 하는 등, 많은 생물학적 기능을 가지고 있다. vEP 단백질 분해효소는 V. vulnificus ATCC 29307 균주의 배양액으로부터 분리 되었으며, 프로트롬빈 활성화능과 피브린분해능을 갖고 있다. 따라서 본 연구에서는 이미 알려진 vEP 유전자의 염기서열을 기초로 중합효소 연쇄반응을 통해 이 유전자를 증폭시키고 pFLAG-ATS 발현벡터에 클로닝한 후, 대장균에서 발현시켰다. 재조합 vEP(rvEP로 명명함)는 발현벡터의 주변 세포질 공간(periplasmic space)으로 분비되어 온전한 활성을 갖는 효소로 발현되었다. 발현된 효소는 두 가지 종류의 이온교환 크로마토그래피(HiPrep Q column과 Source Q column)를 이용하여 분리하였고, 45 kDa과 35 kDa의 두 가지 크기로 존재함을 확인하였다. 본 연구에서는 rvEP의 온도, pH, 기질에 대한 반응성, 그리고 억제제에 대한 반응성 등을 중심으로 그 특성을 규명하였고, 위치-지정 돌연변이유도(site-directed mutagenesis) 방법을 이용, 두 개의 돌연변이체 vEP 단백질들(△C100과 G202D)을 제조하여 그 특성을 야생형 vEP 효소와 비교, 분석 하였다. △C100으로 명명한 돌연변이체 단백질은 vEP의 C-말단을 구성하고 있는 100개의 아미노산들을 제거한 돌연변이체이며, G202D는 vEP 단백질의 202번째 아미노산인 글리신을 아스파트산으로 치환한 치환형 돌연변이체 효소이다. △C100 돌연변이체 효소는 rvEP와 비교할 때 20% 정도 낮은 효소활성을 갖고 있었으며, G202D는 약 42% 더 낮은 활성을 보였다. vEP는 프로트롬빈을 잘라 기능성 트롬빈(functional thrombin)을 생성할 뿐만 아니라 교차연결된 피브린을 분해하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 △C100과 G202D 돌연변이체 효소들의 프로트롬빈 활성화능과 피브린 분해능을 야생형 효소의 활성능과 비교, 분석 하였다. 실험결과, △C100과 G202D 효소들은 야생형 vEP 효소능에 비해 각각 58%와 33.1%의 프로트롬빈 활성능을 갖고 있었으며, 피브린 분해능에 있어서도 더 낮은 분해능을 보였다. G202D 효소는 rvEP와 △C100에 비해 고온에 비교적 더 불안정하였으며, △C100 효소는 rvEP와 기질 특이성 등에서 큰 차이를 보였다. 특히 rvEP에 비해 △C100에 의한 감마글로블린, 피브리노겐, 프로트롬빈 등의 절단이 현저하게 감소하는 것을 확인 하였으며, 금속이온에 대해서도 서로 다른 민감도를 가지고 있다는 사실을 규명하였다. △C100과 G202D 효소의 활성에 미치는 Ni²+과 Cu²+이온의 영향을 분석한 결과, rvEP는 Ni²+ 이온에 의해 약 75%의 효소활성이 감소한데 비해 ?C100은 60%의 효소활성이 감소하는 것으로 보아 이 돌연변이체 효소는 rvEP보다 Ni2+이온에 더 큰 민감성을 보인다는 사실을 알 수 있었다. G202D효소는 Cu2+이온에 의해 효소활성이 43% 감소한 반면, rvEP는 27%의 효소활성이 감소한 것으로 보아 G202D가 Cu2+이온에 의해 rvEP보다 더 민감하다는 것을 알 수 있었다. 따라서 이러한 결과를 종합하여 볼 때, vEP의 C-말단 부분은 기질과의 결합반응에서 중요한 역할을 하는 것으로 생각되며, 202번째 글리신 아미노산이 효소의 온도에 대한 안정성에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 판단된다.

목차 (Table of Contents)

• LIST OF TABLES = iii
• LIST OF FIGURES = iv
• ABSTRACT = vi
• I. INTRODUCTION = 1
• II. MATERIALS and METHODS = 5
• II-1. Materials = 5
• II-2. Cultivation of Vibrio vulnificus and E. coli = 5
• ll-3. Cloning of vEP gene = 6
• II-4. Construction of vEP mutants = 6
• II-4-1. Construction of mutant vEP with C-terminal deletion = 6
• II-4-2. Site-directed mutagenensis = 7
• II-5. Enzyme expression and purification = 7
• II-6. Protease activity assay = 10
• II-7. Fluorogenic peptide assay = 10
• II-8. SDS-PAGE analysis = 11
• II-9. Protein assay = 11
• II-10. Analysis of prothrombin activation = 12
• II-11. Fibrinolytic activity assay = 12
• II-12. Characterization of wild type and mutant vEPs = 13
• II-12-1. Effects of temperatures and pH on enzyme activity = 13
• II-12-2. Thermal stability of wild type and mutant vEP = 13
• II-12-3. Effect of inhibitors on protease activity = 14
• II-12-4. Inactivation of vEP by DEPC = 14
• II-12-5. Cleavage patterns of plasma proteins = 14
• II-12-6. Cleavage of insoluble protein = 15
• III. RESULTS and DISCUSSION = 16
• III-1. Cloning of vEP gene = 16
• III-2. Expression and purification of vEP = 19
• III-3. Prothrombin activation by vEP = 24
• III-4. Fibrinolytic activity = 24
• III-5. Effect of assay temperatures on enzyme activity = 25
• III-6. pH-dependence = 29
• III-7. Thermal stability of proteases = 29
• III-8. Substrate specificity = 30
• III-9. Cleavage of insoluble proteins = 31
• III-10. Cleavage of synthetic peptide substrate = 32
• III-11. Effect of inhibitors on enzyme activity = 41
• III-12. Effect of DEPC = 49
• IV. REFERENCES = 51
• IV. 적요 = 56