관류고정을 이용한 백서의 중추신경계 조직의 면역염색 및 특수염색을 통한 계측병리 연구 = Quantitative Neuropathological Assessment of Rat CNS Tissues via Perfution Fixation and Histological Staining

국문 초록 (Abstract)

관류고정은 조직 샘플을 고정하여 그 구조와 세포 성분을 보존하는 중요한 과정이다. 관류고정은 신경조직의 정확한 분석과 보존을 위해 필요한데, 신경조직을 즉시 고정하여 그 구조와 기능을 변형 없이 보존할 수 있도록 한다. 또한, 조직의 생리적 변화를 정지시키고, 세포 및 조직 구조를 변형 없이 유지함으로써 병리학적 검사와 진단의 정확성을 높이는데 기여한다. 후근신경절은 감각신경 세포의 세포체가 모여있는 곳으로 체내 여러 부위에서 오는 감각 신호를 척수로 전달하는 중요한 역할을 한다. 신경계의 구조적 특성과 기능적 변화를 명확하게 파악하기 위해서는 정확하게 분리하여 손상 없이 분석할 수 있어야 한다.
본 연구는 백서의 뇌 및 신경조직의 적출을 위한 신경학적 분석 방법을 확립하고, 면역염색 및 특수염색 기법을 활용하여 정상 조직의 세부 구조를 분석하는 것을 목표로 하고 있다. 연구는 총 다섯가지로 진행되었다. 관류고정, 후근신경절 및 하지신경 적출, 면역염색(NF, GFAP, IBA1), 특수염색(KB Stain), 면역형광염색(DAPI, NeuN, MAP2)의 방법을 확립하였다. 면역염색과 특수염색의 경우 Brain matrix를 사용하여 각 4µm와 16µm 두께로 절편화 하여 염색 진행 후 전체 슬라이드 이미지 스캔하여 단백질 발현의 변화를 확인하였다.
본 연구에서는 관류고정, 후근신경절 및 하지신경 적출, 면역염색, 특수염색, 면역형광염색 등 다양한 조직학적 및 분자생물학적 기법을 사용하여 정상 신경조직의 형태적 및 분자적 특성을 정밀하게 규명하고자 하였다. 관류고정은 신경세포의 구조적 안정성과 조직의 미세환경을 보존하여, 신뢰도를 확보하여 후속 분석이 가능하도록 역할을 하였다. 또한 후근신경절과 하지신경의 안정적인 적출을 통하여 정상 감각신경계의 구조적 특징을 명확히 파악할 수 있었으며, 이 연구결과를 바탕으로 향후 신경질환 병리 모델과의 비교가 가능한 기준 데이터의 토대를 마련하였다.
면역염색 및 면역형광염색은 분자 표지자와 특정 단백질의 정상 발현 패턴을 시각화함으로 신경세포 및 주변 조직의 기초적 특성을 규명하는 데 활용되었으며, 특수염색 기법은 보다 정교한 정상 신경망의 구조적 배치를 관찰할 수 있도록 하였다.
신경독성 병리연구에서 정상 단일군의 결과자료는 대조 자료로서 중요한 토대가 되며, 이후 신경 병리학적 연구에서 관찰되는 조직병리학적 및 분자 변화를 파악하기 위한 기준으로 활용할 수 있을 것이다. 해당 자료는 기초자료로서의 중요한 가치를 가지며 추후 실험에서 참고자료로 사용할 수 있을 것으로 기대된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Perfusion fixation is an essential procedure for preserving tissue architecture and cellular components without structural distortion, thereby ensuring the reliability of histological and molecular analyses of the nervous system. Due to the rapid physiological changes that occur in neural tissues, immediate and accurate fixation is particularly critical. The dorsal root ganglion (DRG) is a key structure composed of sensory neuron cell bodies that transmit sensory information from peripheral tissues to the spinal cord, making it an important target for neurobiological studies.
The aim of this study was to establish standardized methodologies for the extraction of rat brain and neural tissues and to characterize the morphological and molecular features of normal neural tissues using various histological and molecular techniques. The study consisted of five major procedures: perfusion fixation, extraction of dorsal root ganglia and hindlimb nerves, immunohistochemistry (NF, GFAP, IBA1), special staining (Klüver–Barrera stain), and immunofluorescence staining (DAPI, NeuN, MAP2). Tissue sections with thicknesses of 4 µm and 16 µm were prepared using a brain matrix, followed by staining and whole-slide imaging to evaluate protein expression patterns and structural integrity.
The results demonstrated that perfusion fixation effectively preserved neuronal structural stability and the tissue microenvironment, enabling reliable downstream analyses. Stable isolation of the DRG and hindlimb nerves allowed for clear observation of the structural characteristics of the normal sensory nervous system. Immunohistochemistry and immunofluorescence staining successfully visualized normal expression patterns of neuronal and glial markers, while special staining provided detailed visualization of the organization of neural networks.
The findings of this study provide valuable baseline data for normal neural tissue, which can serve as essential control references in neurotoxicity and neuropathological research. The established methodologies and results are expected to contribute to future comparative studies involving pathological models of neurological disorders.

목차 (Table of Contents)

• 제1장 서론 1
• 제1절 연구 배경 1
• 1. 신경독성 1
• 가. 신경독성 물질 1
• 나. 면역염색과 특수염색의 필요성 및 의의 2
• 다.신경독성평가를 위한 계측병리 3
• 라. 본 연구의 필요성 및 목적 4
• 2. 뇌 및 신경 5
• 가. 뇌 5
• 나. 후근신경절 6
• 다. 하지신경 6
• 제2장 본론 8
• 제 1절 실험방법 8
• 1. 실험동물 8
• 가. IACUC 8
• 나. 백서를 이용한 실험동물 모델 활용성 9
• 2. 조직고정 10
• 가. 침지고정 10
• 나. 관류고정 10
• 다. 관류고정 방법 11
• 3. 하지신경 적출 15
• 4. 특수염색 18
• 5. 면역염색 20
• 6. 면역형광염색 23
• 제 2절. 실험결과 27
• 1. 신경적출 27
• 2. 특수염색 31
• 3. 면역염색 33
• 4. 면역형광염색 37
• 제 3장. 결론 및 제언 42
• 1. 결론 42
• 2. 제언 43
• 참고문헌 45
• ABSTRACT 49