Lactan Gum의 생합성과 그 응용 = Biosynthesis of lactan gum and its application

국문 초록 (Abstract)

본 연구에서는 Rahnella aquatilis를 이용하여 여러 가지 당으로부터 lactan gum의 생합성을 시도 하였으며, 그의 산업적 응용 및 그와 관련된 유용한 기능의 개발을 위하여 lactan gum의 유변학적 특성을 고찰하였다.
Lactan gum은 높은 점도를 갖는 음이온성 다당류로, 측정된 모든 lactan gum 농도 0.1%(w/v)-1.5%에서 의가소성을 보였다. 이 때, 의가소성 정도를 나타내는 유동 지수(flow index) n 값은 1%수용액에서 0.37이었다. Lactan gum의 평균 분자량은 Gel Permeation Chromatography (GPC)로 측정한 결과 약 7.0 × 10^6 dalton을 보였다. Sucrose와 lactose 배지에서 생산된 lactan gum은 주 구성당인 mannose, galactose, galacturonic acid 의 몰 비가 약 5 : 3 : 2를 보였으나 galactose, glucose 그리고 fructose 배지에서 생산된 lactan gum은 주 구성당인 mannose, galactose, galacturonic acid의 몰 비가 각각 2 : 4 : 4, 2 : 3 : 5 그리고 7 : 1.5 : 1.5를 보였다. Fructose 배지에서 생산된 lactan gum의 겉보기 점도는 다른 탄소원에 의해 생산된 것보다 큰 값를 보였는데, 이러한 결과는 구성당 중 mannose의 비율이 클수록 점도가 크다는 것과 관련 있는 것으로 생각된다.
Lactan gum 생합성에서 이당인 sucrose와 lactose의 초기 농도가 45 g/ℓ였을 때 lactan gum의 생산량은 31, 29 g/ℓ로 단당인 galactose, glucose, fructose를 기질로 하였을 때보다 훨씬 큰 lactan gum 생산 수율을 보였다. 또한, 혼합 탄소원 I (glucose : galactose = 1 : 1)과 II (glucose : fructose = 1 : 1)를 초기농도 45 g/ℓ로 하여 사용한 경우, 이당을 탄소원으로 이용할 때보다. 수율이 적었지만, 단당을 탄소원으로 사용하였을때보다는 더 큰 수율을 보였다. Lactan gum 생합성의 율속단계로 생각되는 Uridine 5'-diphosphate (UDP): glucose 4-epimerase (UDP-glucose 와 UDP-galactose를 상호전환시킴)의 활성은 발효 10시간 후부터는 단당보다 이당에서 높게 나타났다.
Rahnella aquatilis는 glucose를 phosphoenolpyruvate (PEP)에 의존한 glucose phosphotransferase system (PEP:PTS)에 의하여 흡수 전달한다. 그러나, 이 균주의 galactose와 lactose 흡수전달은 proton motive force에 의해 촉진되는 능동전달(active transport)에 의해 수행된다.
Rahnella aquatilis에 의해 생산되는 β-galactosidase의 fermentation에 관한 연구가 여러가지 탄소원에 따라 고찰되어졌다. β-galactosidase는 기질이 lactose나 galactose일 때 유도되었지만 glucose, sucrose에서는 강력하게 억제 되었다. 단백질당 β-galactosidase 활성은 ammonium sulfate, DEAE-sephadex A-50 ion exchange chromatography, sephadex G-200 gel filtration을 통하여 약 42배정도 증가되었다. 정제된 β-galactosidase는 40℃에서 최고 활성을 보였으며, o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) 기질하의 반응액에서 K_m값은 0.83 mM이었고, V_(max),는 약 0.17 U/mg·protein·min이었다.
Lactan gum에 의하여 제조된 필름은 기존의 polyethylene 필름보다 기체 투과도가 낮았다. 또 lactan-chitosan 필름의 인장강도는 lactan과 chitosan을 단독으로 사용하였을 때 보다 증가되었다. DDS (drug delivery system)에서의 이용 가능성을 확인하기 위하여 lactan gum(수용성)을 이용하여 lactan acetate(불수용성)를 제조하였다. 이를 이용하여 제조된 microsphere는 위내와 같은 pH 1.2에서는 약물이 거의 방출되지 않았지만, 장내와 같은 pH인 7.4에서는 빠른 약물방출거동을 보였다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The biosynthesis of lactan gum was investigated using Rahnella aquatilis on various carbon sources. The rheological properties of the aqueous solution of lactan gum were also studied in order to determine the usefulness of this polysaccharide in commercial applications.
Lactan gum is highly viscous anionic polysaccharide. The flow behaviour of its aqueous solution is pseudoplastic at all concentration studied (viz. 0.1%(w/w) to 1.5%). The measured degree of pseudoplasticity or flow index was 0.37 at the concentration of 1% (w/w).
The average molecular weight determined by using gel permeation chromatography (GPC) was 7.Ox10^6 dalton. The lactan gums produced on lactose or sucrose contain mannose, galactose and galacturonic acid in the approximate molar ratio of 5:3:2. Moreover, the lactan gums produced on galactose, glucose and fructose contain mannose, galactose and galacturonic acid in the molar ratio of 2:4:4, 2:3:5 and 7:1.5:1.5 respectively. Steady state shear viscosity of lactan gum produced on fructose was higher than that produced on other carbon sources. From this result, it can be inferred that the viscosity of lactan gum solution increases with the increase of mannose content.
With an initial concentrations at 45 g/ℓ of sucrose or lactose, the level of lactan gum produced were 31 g/ℓ and 29 g/ℓ respectively, The yield was more than 60% in both cases. The yield was greater than when dissacchrides (viz. lactose and sucrose) were used as the carbon source instead of monosaccharides (viz. glucose, galactose, fructose).
The amount of lactan gum produced using two different mixtures of monosaccharides (glucose:galactose=1:1 and glucose:fructose=1:1) at the concentration of 45 g/ℓ was higher than that produced using the monosaccharides individually at the same initial concentration. However, the result was similar to that obtained using disaccharide (lactose or sucrose) at 45 g/ℓ. The UDP:glucose 4-epimerase, which can convert UDP:glucose to UDP:galactose, activity was found to be higher at 10 h of fermentation when the organism was grown on disaccharides.
Rahnella aquatilis transport glucose via phosphoenolpyruvate (PEP) transferase system where glucose is assimilated via the Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) pathway. But the present strain carries out an active transport of galactose and lactose which is facilitated by proton motive force.
Studies on the synthesis of β-galactosidase from Rahnella aquatilis were carried out using different carbon sources. The synthesis of enzyme was induced by lactose and galactose but was strongly inhibited by glucose and sucrose.
β-galactosidase was purified using ammonium sulfate precipitation, DEAE-Sephadex A-50 ion exchange chromatography and Sephadex G-200 gel filtration in sequence. The Specific activity of the enzyme was increased 42 fold through purification procedure. The purified enzyme showed the highest activity in potassium phosphate buffer at 40℃. The K_m, and V_(max) were estimated 0.83 mM and 0.17 U/mg protein respectively using ONPG as substract.
Film prepared from lactan gum has lower gas (O₂, CO₂) permeability than polyethylene film and the tensile strength of lactan/chitosan film was found to be higher than the film prepared using lactan or chitosan individually.
Lactan acetate was synthesized in order to find an application in drug delivery system(DDS). Microsphere prepared from lactan acetate was effective in releasing drug at higher pH (7.4).

목차 (Table of Contents)

• List of Figures = i
• List of Tables = vi
• 초록 = vii
• I. 서론 = 1
• 1.1 연구배경 = 2
• 1.2 연구내용 = 4
• 1.2.1 Lactan gum의 유변학적 특성 연구 = 4
• 1.2.2 다당류의 생합성 = 6
• 1.2.3 탄소원의 소비와 흡수전달계 = 8
• 1.2.4 β-galactosidase의 정제 = 15
• 1.2.5 Lactan gum의 응용 = 17
• 1.2.5.1 필름의 제조 = 17
• 1.2.5.2 약물방출시스템의 이용 = 18
• 1.3 연구목표 = 19
• II. 재료 및 실험방법 = 20
• 2.1 균주 및 배양 = 20
• 2.1.1 사용균주 = 20
• 2.1.2 배양실험 = 20
• 2.2 분석방법 = 23
• 2.2.1 전자현미경 관찰 = 23
• 2.2 2 발효액 및 lactan gum의 점도측정 = 23
• 2.2.3 탄소원의 농도측정 = 23
• 2.2.4 단백질의 정량 = 24
• 2.2.5 β-galactosidase의 활성측정 = 24
• 2.3 Lactan gum 생성의 확인 및 물성측정실험 = 25
• 2.3.1 Lactan gum의 정제 = 25
• 2.3.2 Lactan gum의 확인실험 = 25
• 2.3.3 Lactan gum의 가수분해 = 25
• 2.3.4 Lactan gum 분자량의 측정실험 = 26
• 2.3.5 Lactan gum의 differential scanning calorimetry (DSC) 분석 = 26
• 2.4 Lactan gum의 발효실험 = 26
• 2.4.1 배지내의 lactan gum의 농도측정 = 26
• 2.4.2 배지내 유기산농도의 측정 = 26
• 2.4.3 건조 균체량의 측정 = 26
• 2.4.4 UDP:glucose 4-epimerase의 활성 측정 = 28
• 2.5 당의 흡수전달계 분석실험 = 28
• 2.5.1 Toluen treated cell 및 cell free extract 제조 = 28
• 2.5.2 PEP:phosphotransferase, glucokinase 및 galactokinase의 활성측정 = 28
• 2.5.3 당 전달 시스템의 관찰 = 29
• 2.6 β-galactosidase의 정제실험 = 30
• 2.6.1 조효소액의 조제 = 30
• 2.6.2 Ammonium sulfate fractionation = 30
• 2.6.3 DEAE-Sephadex A-50 ion exchange chromatagraphy에 의한 정제 = 30
• 2.6.4 Sephadex G-200 gel filtration에 의한 정제 = 32
• 2.6.5 정제 효소의 효소학적 특성실험 = 32
• 2.6.6 SDS-PAGE에 의한 확인 = 33
• 2.7 Lactan gum film제조 및 물성측정 = 34
• 2.7.1 Lactan gum의 화학적 수식 = 34
• 2.7.2 Lactan 필름의 제조 = 34
• 2.7.3 필름의 인장강도 및 신장률측정 = 34
• 2.7.4 O₂ 및 CO₂의 투과도측정 = 35
• 2.8 Lactan acetate microsphere의 제조 및 약물방출실험 = 35
• 2.8.1 Indomethacin이 봉입된 microsphere의 제조 = 35
• 2.8.2 Microsphere에 봉입된 indomethacin의 농도측정 = 36
• 2.8.3 In vitro에서 indomethacin의 방출 = 36
• III. 결과 및 고찰 = 37
• 3.1 Lactan gum의 특성실험 결과 = 37
• 3.1.1 Lactan gum의 확인 = 37
• 3.1.2 Lactan gum의 유변학적 특성 = 37
• 3.1.3 각 생산 탄소원에 따른 lactan gum의 특성 = 43
• 3.1.4 Lactan gum의 differential scanning calorimetry 분석 = 47
• 3.2 Lactan gum의 생합성 = 53
• 3.2.1 진탕배양 = 53
• 3.2.2 발효조 실험 = 53
• 3.2.3 각 탄소원의 비교 검토 = 68
• 3.2.4 Lactan gum 생산성에 대한 탄소원으로서 이당과 단당의 비교 = 75
• 3.3 당의 흡수전달계 = 80
• 3.3.1 각 당의 소비 = 80
• 3.3.2 각 당의 흡수전달계 = 80
• 3.3.3 Lactose 흡수전달에 대한 glucose의 저해 = 93
• 3.3.4 Phosphate 농도가 발효에 미치는 영향 = 104
• 3.4 β-galactosidase의 특성연구 = 107
• 3.4.1 배양온도와 초기 pH의 영향 = 107
• 3.4.2 탄소원의 영향 = 107
• 3.4.3 β-galactosidase의 정제 = 111
• 3.4.4 정제된 β-galactosidase의 온도 의존성 = 117
• 3.4.5 반응 속도 상수 = 117
• 3.5 Lactan gum의 응용 = 120
• 3.5.1 필름에의 응용 = 120
• 3.5.2 약물전달 시스템으로의 응용 = 126
• IV. 결론 =134
• ABBREVIATIONS = 136
• REFERENCES = 138
• ABSTRACT = 148