유아 분변에서 분리한 Lactobacillus acidophilus의 특성 및 표면 단백질 유전자 slp 크로닝과 대장균내에서의 발현

국문 초록 (Abstract)

본 연구는 Lactobacillus acidophilus를 유아의 분변에서 동정하고, L. acidophilus의 SLP-A을 이용한 표면발현시스템의 개발을 위해, E. coli 내에서 slpA 유전자(surface-layer protein A gene)를 클로닝하여 발현시키고 slpA 유전자 염기서열 조사 및 발현 단백질 SLP-A를 분석하였다.
1. 유아의 분변에서 L. acidophilus로 분리하고, 분리된 균주를 L. acidophilus KLA 1012로 명명하였다.
2. slpA 유전자를 포함한 pTSLP-A와 slpA 유전자의 일부를 포함한 pTSLP-AI, pTSLP-AII, pTSLP-AIII를 얻고, 확인하기 위해 slpA 유전자의 1.4 kb PCR 산물을 probe로 사용하여 Southern blotting을 시행하여 확인하였다.
3. L. acidophilus KLA 1012의 slpA 유전자 1,338 bp를 염기서열 분석 결과 L. acidophilus ATCC 4356의 slpA 유전자와 일치하는 것으로 확인되었다.
4. L. acidophilus KLA 1012의 SLP-A를 이용한 Western blotting 결과 pQESLP-A를 포함하는 E. coli M15 내에서 45.2 kDa SLP-A가 발현되었다.
5. SLP-A의 아미노산 서열은 N-말단 부분에 signal sequence가 확인되었고, 대분분 소수성 아미노산과 양전하 아미노산으로 구성되는 양전하 단백질로 확인되었다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

L. acidophilus KLA 1012 was isolated from infant's feces. For the construction of surface expression host-vector system, cloning of slpA gene of SLP-A(Surface-layer protein A) was performed and the nucleotide sequences were analyzed .
The 1.4 kb PCR product of slpA gene was cloned and confirmed in pTSLP-A by Southern blotting. The nucleotide sequence of slpA gene DNA were identical with those of L. acidophilus ATCC 4356. The 45.2 kDa surface-layer protein band were examined by SDS-PAGE using E. coli M15 transformant containing recombinant plasmid pQESLP-A. Western blotting was performed by using multiclonal antibody produced by L. acidophilus KLA 1012 SLP-A protein. And subclones of slpA gene, which were deleted in part, were constructed.
Amino acid sequences of SLP-A converted from nucleotide sequences information had signal sequence at N-terminal portion, and it was consisted of positive charged amino acid mainly of Lysine.
To construct Lactobacillus delivery system to suface display of heterologous protein by using SLP-A on the Lactobacillus cell surface, more studies on the detailed structure of surface-layer protein is needed.

목차 (Table of Contents)

• 목차
• 목차 = i
• ABSTRACT = v
• I. 서론 = 1
• II. 재료 및 방법 = 6
• 1. 실험 재료 = 6
• 1.1. 균주 = 6
• 1.2. 플라스미드 = 6
• 1.3. 사용 배지 및 시약 = 8
• 1.4. Primer = 11
• 2. 실험 방법 = 13
• 2.1. 유산균의 분리 = 13
• 2.2. 분리 균주의 동정 = 13
• 2.3. 염색체 DNA 분리 = 15
• 2.4. Primer 제작 = 16
• 2.5. PCR(Polymerase chain reaction) = 17
• 2.6. 클로닝과 형질전환 = 18
• 2.7. 재조합 플라스미드 분리 = 19
• 2.8. 제한 효소의 처리와 전기 영동 = 21
• 2.9. Southern Hybridization = 22
• 2.10. slpA 유전자의 염기서열 분석 = 25
• 2.11. Surface-layer protein 정제 = 26
• 2.12. SDS-PAGE 분석 = 27
• 2.13. Polyclonal antibodies 제조 = 28
• 2.14. Western blotting = 29
• III. 결과 = 31
• 1. Lactobacillus acidophilus의 분리와 동정 = 31
• 2. slpA 유전자 클로닝 = 35
• 3. slpA 유전자의 염기서열 분석 및 비교 = 41
• 4. E. coli 내에서 형질발현 = 44
• IV. 고찰 = 46
• V. 요약 = 50
• 참고 문헌 = 51