차세대 시퀀싱 기술을 이용한 MMR(mismatch repair) 특이적인 항암물질 개발 = Identifying MMR(mismatch repair) specific chemotherapeutic drug using next generation sequencing

국문 초록 (Abstract)

Ⅰ. 연구개발의 목적 및 필요성 : 최근 차세대 시퀀싱의 발전과 가격의 하락으로 인해 개개인의 유전체에 맞는 치료법을 개발할 수 있다는 가능성이 제시되고 있음. 높아지는 개인 유전체 검사의 관심은 유전자 특이적인 신약 개발에도 관련이 깊음. 본 연구의 약물 처리와 관련된 유전체 분석 파이프라인이 완성되는 경우 임상까지의 신약 개발과 신약 발굴의 시간과 비용의 절약에 도움이 될 것으로 생각됨.
Ⅱ. 연구개발의 내용 : DNA mismatch repair(MMR) pathway는 환경이나 유전적인 영향으로 인하여 DNA복제과정 중에 잘못된 염기서열이 끼어들어가 거나 삭제되어 염기서열이 비정상적으로 짝이 맺어지는 경우 그것을 복구하는 pathway로서 유전체의 항상성 유지에 아주 중요 한 세포 기작이라고 할 수 있음. 이러한 유전자의 염기서열이 비정상적으로 짝이 맺어진 부분을 처음으로 인식하는 것이 MSH2/6(MutSalpha) 혹은 MSH2/3(MutSbeta) heterodimer임. MutSalpha의 경우 CHK2라는 세포주기와 세포자멸에 관여하는 유전자와 관련이 깊은 것으로 알려져 있으나 아직 정확한 기작이 알려져있지않음. 본 연구실에서는 DNA repair에 관련된 ATAD5 라는 유전자를 대상으로 luciferase high-throughput genotoxicity assay를 통해 3십만여개 약물 스크리닝을 수행. 289개의 후 보 약물을 발견. 이 약물들을 대장암의 한종류인 린치 증후군에 처리하여 MSH2 유전자 넉아웃된 경우에 종양세포를 죽이는 지 관찰. MSH2가 넉아웃되어 MMR pathway가 정상적으로 작용하지 않는 세포주의 경우 후보 약물군에서 나온 한 약물인 baicalein을 처리하는 경우에 종양세포가 많이 죽는 것을 발견함. 동물 실험에서도 이 약물을 종양 양 옆에 pellet으로 처리하였을 시에 종양의 크기가 줄어듬을 확인함. 이에따라 종양세포를 MMR pathway특이적으로 죽이는 이 약물이 정확히 MSH2와 다른 어 떠한 유전자와 pathway에 관련이 깊은지를 알아보기 위해 마이크로 어레이와 차세대 시퀀싱을 수행.
Ⅲ. 연구개발결과 : 본 연구실에서 수행한 3십만여개의 약물 스크리닝 결과 나온 후보 약물 중, Baicalein이라는 약물이 대장암 세포주에서 MSH2 유 전자 발현을 억제시키고 MMR pathway deficient한 상태로 만들었을 때, 동물 실험에서 대조군과 확실한 차이를 보이며 암 세포 를 죽이는 것을 관찰함. 이에 따라 이 약물과 관련하여 MSH2 유전자에 관련된 pathway를 분석하기 위해 마이크로어레이와 RNAseq을 수행. 마이크로어레이 결과에서 두 개의 유전자(CYP1A1, CYP1B1)가 관련성이 높은 것으로 나옴. 두 유전자 모두 약 물 대사에 관련된 유전자로 아직 명확한 대사 기작이 연구되어있지 않은 새로운 타겟임.
Ⅳ. 연구개발결과의 활용계획 : 차세대 시퀀싱을 이용한 종양 억제 신약 개발 파이프라인을 구축하게 되면 여러 유전자의 발현 양상을 기존 전체적인 mRNA 양 상만을 보는 방법에서 실시간으로 실제 단백질로 번역되고 있는 유전자의 발현 양상을 구체적으로 알게 될 수 있음. 그러므로 유전자 특이적인 신약 개발의 후보 발굴 파이프라인을 구축하여 제공 가능함.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The DNA mismatch repair (MMR) pathway plays a key role in the maintenance of genome stability by removing base-base mismatches and insertion/deletion loops that arise during DNA replication or as a result of DNA damage. These DNA lesions are first recognized by the MSH2/MSH6 (MutSalpha) or MSH2/MSH3 (MutSbeta) heterodimer, which in turn recruits the MLH1/PMS2 (MutLalpha) or MLH1/PMS1 (MutLbeta) proteins. The MutS/MutL complex then loads exonuclease I to degrade the strand containing the mispair, and the resulting gap is filled in by Polymerase delta. The MMR proteins can also affect cell cycle control and apoptosis in response to certain types of DNA damage. For example, MutSalpha associates with CHK2 and is required for CHK2 activation. But how MutSalpha regulates CHK2 activation is still not clearly understood. Impairing cell division of rapidly dividing cancer cells by small molecules has been a primary goal in the development of chemotherapeutic agents. However, Lynch Syndrome tumors have proven to be resistant to most conventional chemotherapeutic agents. Here we identified baicalein as a small molecule that could selectively kill MutSalpha-deficient cancer cells. Baicalein binds preferentially to mismatched DNA and induces a DNA damage response in a mismatch repair-dependent manner. In MutSalpha-proficient cells, baicalein can directly bind to MutSalpha and induce dissociation of CHK2 from MutSalpha. Dissociated CHK2 is then phosphorylated by ATM and activated to arrest cells in S phase for cell survival. In contrast, baicalein-mismatched DNA adducts do not induce a DNA damage response in MutSalpha-deficient cells. Continued replication in the presence of baicalein-mismatched DNA results in a high number of DNA double-strand breaks and ultimately leads to apoptosis. Lastly, baicalein treatment shrinks the xenografted tumors formed only from MutSalpha-deficient cancer cells. Thus, we wanted to find the specific pathway of baicalein related to MSH2 deficiency, we made MSH2 gene knocked-down HT29 cell line with baicalein treatment and proceeded microarray and RNAseq. We found two candidate genes which related to cell metabolism. Collectively, we uncovered the molecular mechanism of the MutSalpha-dependent checkpoint activation using the small molecule baicalein, and demonstrated that baicalein offers an improved treatment option for patients with tumors having mismatch repair deficiency.