Studies on the Genes Involved in Keratinocyte Differentiation

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

In mammals, the epidermis is a stratified epithelium that acts as a barrier preserving the organism from dehydration, uncontrolled thermoregulation and potentially environmental damage. It requires a correct balance between proliferation, differentiation and controlled apoptosis. The process of differentiation implies that basal keratinocytes cease to proliferate, lose adherence to the basement membrane and migrate to outer layers called spinous (SL), granular (GL) and stratum corneum (SC). During human skin development, basal cells move outwards. The gene expression of basal keratinocytes such as keratin K5 is repressed and switches towards differentiation specific markers including keratins K1 and K10.
Terminal differentiation of skin keratinocytes is a vertically directed multi-step process that is tightly controlled by the sequential expression of a variety of genes. Previously I examined the gene expression profile, throughout the study, many differentiation-related genes are found to be expressed in a temporally-regulated manner.
In this study, I attempted to find the hub-molecules and their intracellular signaling networks during keratinocyte differentiation using in silico analysis of data obtained from previous studies. I used protein-protein interaction prediction software called PSIMAP, and drew a hypothetical signaling network. I chose one candidate hub molecule SHC1 that was predicted to link EGFR and MAPK signal, and then evaluated the protein-protein interactions experimentally. As predicted, SHC1 bound to the MEK1 in an EGF-regulated manner. Furthermore, SHC1 bound to the MEK1 and p38 MAPK in a keratinocyte differentiation -dependent manner. These results demonstrate that in silico protein-protein interaction prediction system can be used to efficiently and cost-effectively select the experimental candidates.
Also I selected another candidate molecule glucocortioid receptor (GR) that was predicted to involve in keratinocyte differentiation and to play a important role in this conditions. Glucocorticoids (GC) are a class of characterised by an ability to bind with the glucocorticoid receptor and mediate profound and diverse physiological effects in vertebrate development, metabolism, neurobiology and programmed cell death. Although glucocorticoid (GC) analogs are widely prescribed as the treatment of choice in many cutaneous disorders, the role of GCs in skin development has not been completely deciphered. Since GC effects are mediated through the glucocorticoid receptor (GR), studying the impact of the gain- and loss of- function of GR in skin development and function through genetically modified mice constitutes a relevant issue from the basic and clinical perspective.
GR acts through the so-called genomic and non-genomic actions exerting pleiotropic roles in many tissues including skin. GR belongs to the superfamily of steroid nuclear receptors and is a ligand-dependent transcription factor. In the absence of ligand, GR resides in the cytoplasm associated with chaperones such as Hsp90 in an inactive form. Upon ligand binding, GR dissociates from cytoplasmic complexes, dimerizes and translocates to the nucleus, where it can then regulate gene transcription by binding to positive and negative glucocorticoid response elements (GREs).
In an attempt to delineate the mechanism responsible for the beneficial versus adverse effects of GR in epidermal keratinocytes, I investigate the molecular events of GR involved in keratinocyte differentiation. As a result, the endogenous GR expression was increased in suprabasal region of epidermis of human tissue, also in differentiating keratinocyte by calcium. The involucrin, the early differentiation marker of keratinocyte, was increased by GR overexpression in immortalized human keratinocyte HaCaT. In addition, GR overexpression was sufficient to cause MAPK activation in a ligand-independent manner.

국문 초록 (Abstract)

포유동물에서, 표피층은 탈수현상과 체온조절 및 특히 주변 환경으로 인한 위험으로부터 개체를 보호하는 장벽으로서의 역할을 하는 층상구조의 상피세포층이다. 표피층이 이러한 역할을 정상적으로 수행하기 위해서는 표피층을 이루는 세포의 증식과 분화 그리고 세포사멸간에 정확한 밸런스가 절대적으로 필요하다. 세포분화의 과정은 기저 각질형성세포가 증식을 멈추고 기저막에서 떨어져 나와 유극층, 과립층, 마지막으로 각질층이라고 불리는 최외각층 쪽으로 이동하는 것을 일컫는다. 인간의 피부 발생 과정에서, 기저세포가 안에서 바깥쪽 방향으로 이동하면서 기저 각질형성세포의 keratin K5 같은 유전자 발현은 억제되고 keratins K1, K10같은 분화 특이적 마커들의 발현은 올라가는 식으로 전체적인 유전자의 발현이 스위칭된다. 피부 각질형성세포의 최종 분화 과정은 다양한 유전자의 순자척 발현이 정교하게 조절되면서 다양한 단계의 과정이 수직방향으로 전개된다.
본인은 이전에 유전자 발현 profile을 조사하였고 temporally-regulated manner로 발현되면서 분화를 조절하는 것과 관련된 다양한 유전자를 찾아내었다.
이번 연구에서 본인은 이전 연구에서 얻어진 데이터를 바탕으로 in silico 분석법을 이용하여 hub-molecule들과 함께 각질형성세포 분화 과정에서 그것들의 intracellular signaling networks를 찾아내고자 시도하였다. 본인은 PSIMAP이라 불리는 protein-protein interaction prediction software를 사용하여 가상의 신호 전달 네트워크를 그릴 수 있었다. 여기서 hub-molecule 후보유전자들 중, SHC1이 EGFR 과 MAPK signal을 연결할 것이라 예측하고 protein-protein interaction을 실험적으로 증명해보았다. 예측한대로SHC1이 MEK1에 EGF-regulated manner로 결합함을 알 수 있었고, 나아가 SHC1이 keratinocyte-differentiation dependent manner로 MEK1 과 p38 MAPK에 결합하는 것 또한 알 수 있었다. 이러한 결과를 얻음으로써 in silico protein-protein interaction prediction system이 효율적으로 그리고 비용 절감에 효과적으로 실험적 후보자를 선택하는 데에 사용될 수 있음이 밝혀졌다.
또한 본인은 각질형성세포의 분화에 관여하여 중요한 역할을 할 것이라 예상되는 glucocorticoid receptor (GR)를 또 다른 후보 유전자로 선택하였다. Glucocorticoids (GC)는 glucocorticoid receptor에 결합하여 척추동물의 발생과 대사과정, 뇌생물학, 세포사멸 같은 주요하고 다양한 생리활성을 매개하는 것으로 잘 보고가 되어 있다. 비록 glucocorticoid (GC) analogs 가 많은 피부 질환에 처리하는 약물로 보편화되어 있기는 하나 피부 발생에서GC의 역할은 아직 완전하게 규명되어 있지 않은 실정이다. GC의 효과는 glucocorticoid receptor(GR)를 통하여 나타나기 때문에 피부 발생 단계에서GR의 gain/loss- of-function이 미치는 영향과 함께, 유전적으로 변형시킨 생쥐를 통하여 기능을 연구하는 것은 기초와 임상관점에서 상응하는 이슈를 제공해줄 수 있다. GR은 피부를 포함하여 다양한 조직에서 다면발현적으로 역할을 하면서 genomic/non-genomic action으로 작용한다. GR은 steroid nuclear receptor 의 superfamily에 속하며 ligand-dependent transcription factor 이다. Ligand가 없을 때, GR은 Hsp90같은 chaperones과 결합하여 불활성화 상태로 세포질에 존재하지만, ligand와 결합하게 되면 GR은 세포질 내 복합체에서 해리되어 dimer를 이루면서 핵으로 translocation되고 그 곳에서 positive/negative glucocorticoid response elements (GREs)에 결합함으로써 유전자의 전사를 조절할 수 있게 된다.
Epidermal keratinocyte에서 GR의 유익한 효과와 역효과를 설명하기 위한 mechanism을 알아보기 위하여 본인은 각질형성세포의 분화에 관련된 GR의 molecular events를 조사하여 보았다. 본인의 데이터상으로, 인간조직 표피의 suprabasal region이나 칼슘으로 분화를 유도한 각질형성세포 모두에서 GR의 endogenous단백질의 발현이 증가됨이 관찰되었고, immortalized human keratinocyte HaCaT 에서 각질형성세포의 초기 분화마커인involucrin 역시 GR의 과발현에 의해 발현이 증가함을 보였다. 게다가 GR의 과발현이 ligand independent manner로 MAPK activation을 야기시키는 충분한 증거가 됨을 증명하였다.

목차 (Table of Contents)

• INTRODUCTION 1
• PART Ⅰ. Prediction and evaluation of proteinprotein interaction in keratinocyte differentiaion 6
• Introduction 7
• Materials and Methods 9
• Protein structure assignment and construction of proteinprotein interaction network 9
• Cell culture 11
• Cloning and creation of adenovirus 12
• Immunoprecipitation and Western blot analysis 13
• Results 15
• Prediction of proteinprotein interaction by systems biotechnology 15
• Evaluation of proteinprotein interaction 18
• Discussion 36
• PART Ⅱ. Glucocorticoid receptor plays an important role in differentiation of keratinocyte 40
• Introduction 41
• Materials and Methods 55
• Reagents and Antibodies 55
• Cell culture 55
• Construction of deletion variants of GR 56
• Creation of adenovirus 57
• Western blot analysis 57
• Luciferase assay 58
• Immunohistochemistry 58
• Results 60
• GR is predominantly expressed in the suprabasal layer of the epidermis and hair follicle 60
• Protein levels of GR and INV are increased by high calcium but decreased by dexamethasone 60
• The overexpression of GR alters the protein level of involucrin through activation of GR and induces phosphorylation of ERK and JNK, but not p38 66
• GR deletion variant lacking ligand binding domain affects their ability to induce INV promoter activity and upregulate involucrin protein level and phosphorylate MAPK 75
• Glucocorticoid receptor expression pattern was diminished in epidermis in vivo by dexamethasone and epidermal thickness was decreased in parallel 86
• Discussion 93
• 초록 97
• References 101