Cytokine의 in vitro 대체 시험법 확립 (III) = Establishment of in vitro cytokine assay-III

국문 초록 (Abstract)

본 연구에서는 항암 치료 시 체내 면역능이 떨어지는 환자의 면역력을 높여 일종의 면역 기능 조절제로 사용되는 IL-1과 IL-18의 in vitro 생물학적 활성 시험법을 확립하고자 하였다. IL-1 receptor 고 발현 세포주인 D10S를 이용하여 in vitro IL-1 활성 시험법을 확립하였고 specificity, sensitivity, linearity 등을 항체를 이용한 IL-1 측정법과 비교 분석하였다. IL-18 또한 receptor 고 발현 세포주인 NK cell을 이용하여 in vitro IL-18 활성 시험법을 확립하였고 항체를 이용한 IL-18 측정 방법과 비교하였다. NK cell은 IL-18 활성을 측정하기 위해서는 IL-12가 함께 첨가되어야 하는데, 지속적이고 안정적으로 IL-18 단독으로 활성을 가지는 IL-12 transfectant를 제조하여 간편한 in vitro IL-18 활성 시험법을 확립하고자 하였다. 이들 시험법은 IL-1과 IL-18의 in vitro 생물학적 활성 시험법의 확립으로 면역 기능조절제로 사용되는 이들 제제의 생물학적 효능 검정에 이용될 수 있고 나아가 이들 사이토카인 조절인자들의 탐색 및 효능 검정에 이용될수 있다. 또한 항암 치료 시 체내 면역 능 저하 현상 등, 미미한 사이토카인 변화량을 확인하기 위한 이들 사이토카인의 초정밀 진단 방법으로 PCR/ELISA 방법을 확립하였다. 이는 인체의 각종 염증 및 면역 반응에 관련된 이들 인자들의 측정에 활용 가능할 것이다.○ 연구목표
본 연구에서는 항암 치료 시 체내 면역 능이 떨어진 환자의 면역력을 회복시키거나 면역력을 높여 일종의 면역기능조절제 (immunomodulating agents)로 사용되는 interleukin-1 (IL-1)과 IL-18의 in vitro 생물학적 활성 시험법을 확립하여 이들 생물학적 제제의 생물학적 효능을 효율적으로 검증하는데 이용하고자 한다. IL-1만을 처리하여도 분화하는 D10S를 확립하여 이를 IL-1의 활성을 검정하는데 이용하고자 한다. 또한 IL-18의 활성을 검색하고자 IL-18 receptor를 발현하는 자연살해세포 (natural killer: NK cell)를 이용한 in vitro IL-18 시험법을 확립하고자 하였다. Specificity, sensitivity, linearity 등을 항체를 이용한 ELISA 방법과 비교 분석하여 IL-1과 IL-18 receptor 고발현 세포 주를 이용한 in vitro 시험법을 확립하고자 하였다. 또한 NK cell line에 IL-12p40을 발현시켜 세포증식을 위한 자극으로 이용함으로써 IL-18 receptor에 의한 신호전달 능력을 증강시켜IL-18의 in vitro 생물학적 활성을 좀 더 효율적으로 측정하는데 이용하고자 하였다. 이렇게 확립한 IL-1R, IL-18R 고 발현 세포 주들을 이용, IL-1, IL-18 조절인자들의 동정 및 효능 검정 등에 활용하고자 한다.
○ 연구내용
- IL-1 receptor type I (IL-1RI)과 IL-1R accessory protein 고 발현 D10S 세포주를 클로닝 및 유지하여 이를 이용한 IL-1의 활성 검정 시험법의 확립하였고, IL-18 receptor를 발현하는 NK0 세포주를 이용한 IL-18의 활성 검정 시험법을 확립하였다. 이들 시험법을 specificity, sensitivity, linearity 등에 대해 in vitro ELISA 시험법과 비교 분석하였다.
- 분자 생물학과 생화학적 기술을 이용하여 IL-12 발현 벡터 제조 (pcDNA3.1/IL-12p40, pLXN/IL-12p40) 및 개량하고, IL-12 발현 세포 주를 제조하여 IL-12 처리 없이 IL-18만 단독으로 처리하여 NK0 세포 주를 활성화시켜 IFN-γ를 유도하는 IL-18 효능 검정 시험법을 확립하고자 하였다.
- IL-1R 및 IL-18R 고 발현 세포 주를 이용하여 이들 인자들을 억제하거나 조절하는 물질을 탐색하고 효능 검정하였으며 여러 후보 물질들을 확보하였다.
- 동물 실험시 기존 ELISA 방법으로는 민감도가 낮아 측정하기 곤란한 사이토카인들 (IL-1, IL-6, TNF-α, IL-18)을 측정할 수 있는 in vivo 활성 시험법으로 PCR/ELISA 방법을 확립하였다. Biotin primer/DIG labelled primer를 이용하여 PCR한 후 PCR products를 streptavidin이 coating된 well에 결합시키고 Anti-DIG-HRP를 이용하여 측정하였다.
○ 연구성과(응용분야 및 활용범위포함)
D10S cell line은 본 연구팀에 의해 특허 출원 및 등록해 놓은 cell line으로서 이를 이용한 IL-1 or caspase-1 inhibitor나 modulator의 활성 검사 및 탐색 개발하여 ICE (caspase-1) or caspase3-induced apoptosis를 억제하거나 조절케 함으로써 관절염, 퇴행성 뇌질환 (neurodegerative disease) 등과 같은 난치성 염증 질환 등을 치료하거나 조절하는데 이용될 수 있을 것이다. 또한 NK0 세포를 이용한 IL-18 조절 인자의 시험 검정 및 NK 세포의 활성 인자 탐색 및 동정으로 체내 면역 활성능을 높이는 생리 조절 인자들의 검정에도 활용될 수 있다. 이를 이용해 난치성 질환 유발 인자들을 억제하거나 조절하는 물질의 구조와 기능 간의 분석 연구를 잘 수행해 나갈 수 있고 그 결과 인체 난치성 질환 기전을 이해하는데 중요한 지식을 획득 및 이용할 수 있다. 한국자생식물체 추출물 탐색 및 IL-1, caspase-1 조절 후보 물질 5건 확보 및 동정, 효능 분석, IL-12와 함께 처리시 NK 세포의 활성을 증가시키는 NK 세포활성추출물 3가지를 확보하여 장기적으로 여러 가지 약물에 대한 내성을 보이는 환자에 처리, 면역 활성 효능 증진 등에 활용토록 할 예정이다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

This study was focused on the establishment of in vitro assays for the biologically active cytokines such as IL-1 and IL-18, which enhance or recover the reduced immune responses of patients administered with anticancer drugs. IL-1 and IL-18 are being used as immunomodulating agents. In vivo assays for these biological response modifiers are time-consuming and expensive due to animal experiment, and inaccurate depending on animals. In order to replace in vivo test, Th2 helper cell line D10S, a subclone of Type 2 (Th2) D10G4.1, which responds and proliferates by only IL-1 even in the absence of co-mitogen, has been used. D10S cells expressing lots of IL-1R type I (IL-1RI) and IL-1R accessory protein (IL-1RAcP) were cloned and maintained. D10S cells proliferate by treatment of minimal concentration of IL-1β (2.5 ± 0.5 pg/ml) in the absence of co-mitogen. In addition, in order to establish in vitro test for bioactive IL-18, NK0, a subclone of natural killer (NK) cells, has been used. The surface IL-18 receptor on NK0 cells were increased by IL-12 and NK0 cells produced IFN-γ by IL-18 coincubated with IL-12. Mammalian expression pcDNA3.1 vector or pLXN retroviral vector were used for the expression of IL-12p40 (pcDNA3.1/IL-12p40, pLXN/IL-12p40). Those expression vectors were transfected into NK0 cells in order to replace the addition of IL-12 for the activation of NK0 cells in vitro assay. These NK0/IL-12 cells were used in vitro test for IL-18 because these NK0/IL-12 cells produced IFN-γ by IL-18 in a dose response manner even in the absence of IL-12. In this study, we have used those established cell lines D10S and NK0 cells, which express lots of IL-1R and IL-18R, respectively. Those cell lines are being used for the assays of IL-1- or IL-18-modulating factors. Some of those IL-1- or IL-18-modulating factors have been screened and identified. Their efficacy is being evaluated and characterized for their application.