Study on animal and cellular model of sarcopenia : efficacy and mechanism of action of Lactobacillus gasseri

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Sarcopenia is loss of skeletal muscle and is characterized by a decrease in muscle mass, muscle function, and physical performance. Skeletal muscle loss occurs when the rate of protein breakdown exceeds the rate of protein synthesis. Lactobacillus gasseri is a probiotic strain belonging to Lactobacillus genus. This study aimed to investigate the effects of L.gasseri for ameliorating dexamethasone-induced muscle loss in mice and cultured myotubes. BALB/c mice were i.p. injected with dexamethasone while orally administered with L.gasseri for 21 days. C2C12 myotubes was co-treated with dexamethasone and culture supernatant of L.gasseri in vitro. Protein levels in muscle were measured using western blotting, while serum protein levels were analyzed through enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Messenger RNA levels were quantified using quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-qPCR). L.gasseri ameliorated dexamethasone-induced decline in muscle function measured by forelimb grip strength, treadmill running time and rotarod retention time. The weight of gastrocnemius and quadriceps normalized to body weight were significantly increased by L.gasseri. Lean body mass percent measured by dual energy X-ray absorptiometry were significantly increased, while fat mass was decreased by L.gasseri. Ameliorating effects of L.gasseri were observed in both female and male mice. Levels of major muscular proteins such as myosin heavy chain and myoblast determination protein 1 were significantly increased by L.gasseri. Serum level of myostatin was decreased by L.gasseri. Muscle-specific ubiquitin E3 ligase, MuRF1 and MAFbx/atrogin-1, as well as their transcription factor, FoxO3, were decreased in muscle by L.gasseri. The muscular Akt-mTOR-p70S6K signaling pathway as well as serum level of IGF-1, which induces protein synthesis, were increased by L.gasseri. The dexamethasone-induced atrophy of C2C12 myotubes were significantly ameliorated by the culture supernatant of L.gasseri. Effects of L.gasseri in mice were replicated in C2C12 myotube culture by the culture supernatant of L.gasseri. This study demonstrated that L.gasseri ameliorates muscle loss by inhibiting the protein degradation pathway and activating the protein synthesis pathway.

국문 초록 (Abstract)

근감소증(Sarcopenia)은 골격근의 손실을 의미하며 근육량과 근육 기능, 신체 활동의 저하를 특징으로 한다. 퇴행성으로 인해 단백질 분해 속도가 단백질 합성 속도를 초과할 때 골격근 손실이 야기된다. 락토바실러스 가세리는 락토바실러스속에 속하는 프로바이오틱 균주이다. 본 연구의 목표는 락토바실러스 가세리가 mouse와 배양된 C2C12 myotubes에서 덱사메타손으로 유도된 근육 손실을 개선하는 데 미치는 영향을 조사하였다. Balb/c mouse에 21일 동안 락토바실러스 가세리를 경구투여 하면서 덱사메타손을 복강 내 주사하였다. C2C12 myotubes는 시험관 내에서 덱사메타손과 락토바실러스 가세리 배양 상등액을 동시 처리하였다. 근육내의 단백질 수준은 Western blot으로 정량화되었고 혈청 내의 단백질 수준은 ELISA로 분석되었으며 메신저 RNA 수준은 정량적 역전사 중합 효소 연쇄반응(RT-qPCR)에 의해 측정되었다. 앞다리 악력, Treadmill 달리기 시간 및 Rotarod 유지 시간으로 근육기능을 측정한 결과 덱사메타손 복강주사로 저하된 근육 기능이 락토바실러스 가세리 경구투여로 인해 의미 있게 개선되었다. 체중으로 보정된 비복근과 대퇴사두근의 무게는 락토바실러스 가세리로 인해 의미 있게 증가하였다. 이중 에너지 X-선 흡수법으로 측정한 제지방 비율은 락토바실러스 가세리로 인해 의미 있게 증가한 반면, 지방량은 감소되었다. 락토바실러스 가세리의 개선 효과는 암컷과 수컷 mouse에서 모두 관찰되었다. 마이오신 중쇄(MyHC)와 근아세포 결정 단백질1 (MyoD) 등 주요 근육 단백질의 수준이 락토바실러스 가세리로 인해 의미 있게 증가하였다. 단백질 분해를 일으키는 미오스타틴의 혈청 수준과 근육 특이적 유비퀴틴 E3 리가제인 MuRF1 및 MAFbx/atrogin-1 및 이들의 전사 인자인 FoxO3의 근육 내 수준은 락토바실러스 가세리에 의해 감소되었다. 단백질 합성을 유도하는 IGF-1의 혈청 수준과 근육 내의 Akt-mTOR-p70S6K 신호 전달 경로는 락토바실러스 가세리에 의해 증가하였다. 덱사메타손으로 유도된 C2C12 myotubes의 위축은 락토바실러스 가세리의 배양 상등액에 의해 의미 있게 개선되었다. 마우스에서 관찰된 락토바실러스 가세리의 근육 손실 개선 효과는 락토바실러스 가세리의 배양 상등액에 의해 C2C12 myotubes에서 재현되었다. 이 연구는 락토바실러스 가세리가 단백질 분해 경로를 억제하고 단백질 합성 경로를 활성화하여 근육 손실을 개선한다는 것을 입증한다.

목차 (Table of Contents)

• 1. INTRODUCTION 1
• 2. MATERIALS AND METHODS 4
• 2.1 Reagents 4
• 2.2 Preparation of Lactobacillus gasseri 5
• 2.3 Animal experiments 6
• 2.4 Body composition 8
• 2.5 Skeletal muscle function tests 9
• 2.6 Quantitative Revers-Transcription PCR (RT-qPCR) 10
• 2.7 Western blot Analysis of skeletal muscle 11
• 2.8 Measurement of serum IGF-1 and Myostatin using ELISA 12
• 2.9 In vitro experiments in C2C12 myotube culture 13
• 2.10 Manufacture of Media using L.gasseri 14
• 2.11 Giemsa staining 14
• 2.12 Immunofluorescence 15
• 2.13 Sample preparation from C2C12 myotubes 16
• 2.14 Western blot Analysis of C2C12 myotubes 17
• 2.15 Statistical Analysis 17
• 3. RESULTS 18
• 3.1 L.gasseri ameliorated muscle function and mass in dexamethasone-injected mice 18
• 3.2 L.gasseri protected body composition in dexamethasone-injected mice 23
• 3.3 L.gasseri downregulated muscular protein degradation pathway in dexamethasone-injected mice 26
• 3.4 L.gasseri upregulated muscular protein synthesis pathway in dexamethasone-injected mice 33
• 3.5 L.gasseri evaluation of major muscular proteins in dexamethasone-injected mice 39
• 3.6 L.gasseri culture supernatant ameliorated in dexamethasone-induced atrophy of C2C12 myotubes 44
• 3.7 L.gasseri culture supernatant inhibited muscular protein degradation in dexamethasone-treated C2C12 myotubes 48
• 3.8 L.gasseri culture supernatant enhanced protein synthesis resulting in the elevation major muscular proteins in dexamethasone-treated C2C12 myotubes 51
• 4. DISCUSSION 56
• REFERENCES 60
• 국문초록 65
• ABSTRACT 67