형질전환된 Chinese hamster ovary 세포에서 silkworm gland hydrolysate를 이용한 albumin-erythropoietin의 생산성과 세포사멸 확인

국문 초록 (Abstract)

형질전환된 Chinese hamster ovary(CHO) 세포는 포유동물 세포를 숙주로 하는 재조합 단백질의 상업적인 생산에 있어서 가장 널리 사용되는 세포주이다. CHO 세포는 증폭 시스템으로 dihydrofolate reductase(DHFR) 유전자와 methotrexate(MTX)를 통해 재조합 단백질을 높은 수준으로 발현할 수 있다. 또한 복잡한 단백질의 경우 요구되는 효율적인 post-translational modification(PTM) 과정을 갖추고 있고, 인간에서 질병을 일으키는 polio, HIV, hepatitis B 등은 CHO 세포에서 증식을 하지 않는다. 하지만 이러한 CHO 세포는 미생물에 비하여 낮은 단백질의 생산성이 있다.
최근의 CHO 세포 배양에서 다양한 전략으로 목적 단백질의 specific productivity를 증가시키는 연구가 진행되고 있다. Silkworm Gland Hydrolysate(SGH)은 silkworm hemolymph(SH)에서 유래된 섬유 단백질이다. 항산화제인 SGH는 포유동물 세포 배양에서 세포 증식과 재조합 단백질의 생산량을 증가시키는 영양소로 사용되고 있다. 더욱이 줄기세포와 관련된 많은 참고 문헌에는 세포 성장 측면에서 fetal bovine serum(FBS)과 유사한 효능을 보이고 있는 것을 확인할 수 있다.
Erythropoietin(EPO)는 세계적으로 연간 10 달라(10억불) 이상의 시장규모를 형성하는 블록버스터 제품이다. Human EPO는 3개의 N-linked와 1개의 O-linked oligosaccharide chain으로 형성된 당단백질로서 asialo-EPO가 간에 있는 hepatic asialoglycoprotein receptor(ASGPR)에 반응하면 체내에서 빠르게 제거되기 때문에 sialic acid가 체내의 생물학적인 활성에 중요한 작용을 한다. 최근에 짧은 반감기를 가지는 peptide의 albumin 융합을 통해 체내 순환을 오래 유지할 수 있는 기술이 사용되고 있다. 이 기술을 이용한 albumin-EPO(Alb-EPO)는 human EPO에 albumin을 유전적으로 형질전환 시킨 100 kDa의 단백질로 체내 반감기의 증가와 향상된 약물 전달력 그리고 1회 투여시 요구되는 약물 감소와 같은 장점을 가지고 있다.
본 연구에서는 Alb-EPO를 생산하는 형질전환된 CHO 세포 배양에서 SGH 첨가에 따른 생산성의 효과를 확인하고자 하였다. 그 결과 CHO 세포의 viable cell density와 생존도가 증가하였으며 Alb-EPO의 생산량도 현저하게 증가하였다. 또한 CHO 세포배양에서 사용되는 세포사 저해 물질인 dextran sulfate와 N-acetylcystein과 비교하여도 SGH를 첨가하였을 때 가장 높은 세포 생존도를 보였다. 결론적으로 SGH를 CHO 세포에 첨가해서 세포의 생존도가 증가하였으며 그로 인해, 목적 단백질인 Alb-EPO의 생산량이 증가됨을 확인할 수 있었다.

목차 (Table of Contents)

• 1. 서론 1
• 1.1 생물의약품(Biopharmaceuticals) 1
• 1.1.1 생물의약품 1
• 1.1.2 동등생물의약품(Biosimilars) 2
• 1.2 동물세포배양 6
• 1.2.1 동물세포배양 6
• 1.2.2 Chinese Hamster Ovary(CHO) cell 8
• 1.2.3 재조합 단백질 발현 체계 9
• 1.3 재조합 단백질(Recombinant protein) 10
• 1.3.1 유전자 재조합 기술 10
• 1.3.2 Erythropoietin(EPO) 14
• 1.3.3 Albumin-EPO(Alb-EPO) fusion protein 15
• 1.4 CHO 세포 배양에서 단백질 생산성 증진 방법 18
• 1.4.1 SGH 18
• 1.4.2 Anti-apoptotic agent 19
• 2. 연구 목적 21
• 3. 재료 및 방법 22
• 3.1 세포배양 및 배양조건 22
• 3.1.1 세포주 22
• 3.1.2 세포배양 22
• 3.1.3 첨가물질 22
• 3.2 분석 23
• 3.2.1 세포 수 및 생존도 측정 23
• 3.2.2 배지 내 Alb-EPO의 정량분석 23
• 3.2.3 Metabolite 분석 24
• 3.2.4 Cell cycle 분석 24
• 3.2.5 Cell death 분석 : Apoptosis/Necrosis 26
• 4. 결과 및 고찰 27
• 4.1 회분식 배양에 의한 Alb-EPO 생산 세포의 특성 27
• 4.2 SGH에 의한 Alb-EPO 생산 세포의 생산성 32
• 4.2.1 SGH 농도에 따른 세포의 생장 32
• 4.2.2 SGH 농도에 따른 Alb-EPO 생산성 32
• 4.2.3 SGH 농도에 따른 세포 주기의 분석 34
• 4.3 SGH와 anti-apoptotic agent과의 비교 분석 37
• 4.3.1 Anti-apoptotic agent에 따른 세포 생장의 분석 37
• 4.3.2 Anti-apoptotic agent에 따른 세포 주기의 분석 38
• 4.3.3 Anti-apoptotic agent에 따른 세포의 apoptosis/necrosis 분석 41
• 5. 결론 45
• 6. 참고문헌 47
• 그림목차
• Figure 1. DHFR-mediated gene amplification in CHO cells. 12
• Figure 2. Commercial EPO products. 16
• Figure 3. Advantage of albumin fusion technology. (A) Increase of half-life in vivo and (B) useful of design flexibility. 17
• Figure 4. Structure of SGH in Silkworm. 19
• Figure 5. Time course change of (A) viable cell density and (B) viability in CHO cell batch cultures. 29
• Figure 6. Time course change of (A) glutamine, ammonia concentration and (B) glucose, lactate concentration in CHO cell batch cultures. 30
• Figure 7. Alb-EPO production in batch cultures. 31
• Figure 8. Effect of SGH on (A) viable cell density and (B) viability. Cells were initially cultivated at without SGH (control, ) for 4 day and then cultivated at 0.5 mg/mL SGH addition (), 0.75 mg/mL (), 1 mg/mL (), 1.25 mg/mL (). 33
• Figure 9. Effect of SGH on Alb-EPO production. Cells were initially cultivated at without SGH (control, ) for 4 day and then cultivated at 0.5 mg/mL SGH addition (), 0.75 mg/mL (), 1 mg/mL (), 1.25 mg/mL (). 35
• Figure 10. Effect of SGH on cell cycle at day 6. 36
• Figure 11. Effect of various anti-apoptotic agents on (A) viable cell density and (B) viability. Cells were initially cultivated without anti-apoptotic agents (control, ) for 4 day and then cultivated at 1 mg/mL SGH addition (), 2.5 mM dextran sulfate (), 8 mM NAC (). 39
• Figure 12. Effect of various anti-apoptotic agents on Alb-EPO production. Cell were initially cultivated without anti-apoptotic agents (control, ) for 4 day and then cultivated at 1 mg/mL SGH addition (), 2.5 mM dextran sulfate (), 8 mM NAC (). 40
• Figure 13. Effect of anti-apoptotic agents on cell cycle at day 6. 42
• Figure 14. Effect of anti-apoptotic agents on cell death: apoptosis, necrosis at (A) day 5 and (B) day 6. 44
• 표 목차
• Table 1. Top classes of biopharmaceuticals with 2010 sales 3
• Table 2. Patent expiry of blockbuster biopharmaceuticals 5
• Table 3. EU biosimilars approvals, status 2010 7
• Table 4. FDA approved recombinant proteins 13
• Table 5. Buffer composition for ELISA 25