L-trans-pyrrolidine-2,4-dicarboxylate에 의한 배양 신경세포사멸에 대한 Gi/o 단백 연계 수용체에 작용하는 각종 약물의 영향 = Effects of some Gi/o-linked receptor agonists on the neuronal death induced by L-trans-2,4-PDC in cultured cortical neurons

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Brain ischemia increases the synaptic glutamate concentration by inducing functional deficit of glutamate transporters, and the increase of glutamate produces excitotoxic neuronal death. L-trans-pyrrolidine-2,4- dicarboxylate (L-PDC), a glutamate transporter inhibitor, could induce excitotoxic neuronal death in cultured neurons. It has been well-known that the activation of Gi/o-linked receptor attenuates the release of neurotransmitters. To establish the in vitro model for screening neuroprotective agents, the effects of some Gi/o-linked receptor agonists on the neuronal death induced by 200 μM L-trans-2,4-PDC were examined in mixed cortical cultures. The cortical cultures at 13-14 days in vitro were used. Cell death was assessed by measurement of lactate dehydrogenase efflux to bathing media at the end of 24 hr exposure.
The neuronal death induced by the L-PDC was significantly attenuated by treatment with NMDA receptor antagonists. The treatment with L-PDC for 1-2 hrs produced about 8-fold increase of glutamate concentration in culture media. Pre-treatment with clonidine (1-30 μM), an α2 adrenoceptor agonist, attenuated the L-PDC-induced neuronal death concentration-dependently. The inhibitory action of 10 μM clonidine was reversed not only by treatment with 10 μM yohimbine or 10 μM rauwolscine, α2 adrenoceptor antagonist, but also by pre-treatment with pertussis toxin (PTX, 10 ng/ml), a Gi/o protein inhibitor. Guanabenz (1-10 μM), another α2-adrenoceptor agonist, inhibited the neuronal death in a concentration-dependent manner and the inhibitory action of 10 μM guanabenz was reversed by yohimbine or PTX. Bromocriptine (1-10 μM), dopamine D₂ receptor agonist, inhibited the neuronal death in a concentration-dependent manner and the inhibitory action of 10 μM bromocriptine was reversed by 20 μM sulpiride, a dopamine D₂ receptor antagonist, or PTX. Methacholine (3-30 μM), a muscarinic receptor agonist, inhibited the neuronal death in a concentration-dependent manner and the inhibitory action of 10 μM muscarine was reversed by 10 μM atropine, a muscarinic receptor antagonist, or PTX. Baclofen (5-20 μM), a GABA_(B) receptor agonist, inhibited the neuronal death in a concentration-dependent manner and the inhibitory action of 10 μM baclofen was reversed by 200 μM 2-hydroxysaclofen, a GABA_(B) receptor antagonist, or PTX. U50488 (0.1-1 μM), a κ opioid receptor agonist, inhibited the neuronal death in a concentration-dependent manner and the inhibitory action of 1 μM U50488 was reversed by 10 μM naloxone, an opioid receptor antagonist, or PTX. Pretreatment with clonidine (10 μM), guanabenz (10 μM), bromocriptine (10 μM), methacholine (10 μM), baclofen (10 μM) or U50488 (1 μM) significantly attenuated the L-PDC-induced increase of glutamate concentration in culture media.
These results demonstrated that the activation of Gi/o-linked receptor could inhibit the L-PDC-induced neuronal death by inhibiting glutamate release in cultured neurons, and suggested that the neuronal death by L-PDC in cultured neuron might be useful in vitro model system for screening neuroprotective agents.

국문 초록 (Abstract)

뇌 허혈은 glutamate 수송체의 기능을 저하시켜 연접 강 내 glutamate 농도 증가에 의한 신경세포사멸을 유발한다. 따라서 L-trans-pyrrolidine-2,4- dicarboxylate (L-PDC)와 같은 흥분성 아미노산 수송체 억제제 처리는 허혈 시와 같은 연접 강 내 glutamate의 농도 증가에 따른 신경세포사멸을 유도한다. Gi/o에 연계된 각 종 연접 전 수용체에 대한 작동제 처리가 신경전달물질의 유리를 억제함이 알려져 있다. 따라서 본 연구는 L-PDC에 의한 신경세포사멸에 대한 Gi/o에 연계된 몇 가지 수용체 작동제 처리의 영향을 조사하여, 허혈 등에 의한 신경손상을 억제할 수 있는 신경보호 약물의 검색 방법을 확립하고자 하였다.
태령 15-17일 된 생쥐 대뇌피질 신경세포를 미리 교세포가 배양된 배양접시에 13-14일 배양하여 사용하였으며, 세포사멸은 약물처리 24시간 후에 배양접시의 배지내로 유출된 lactate dehydrogenase의 양을 측정하여 정량하였다.
L-PDC 24시간 처리는 150 μM 까지는 경미한 신경세포사멸을 보이다가 200 μM로 약 80%의 신경세포사멸을 유도하였으며, L-PDC에 의한 신경세포사멸은 NMDA 수용체 길항제 처리로 억제되었다. L-PDC 처리 후 배지 내 glutamate 농도는 1-2 시간 내에 약 8 배 증가하였다. 본 실험에서는 200 μM L-PDC에 의한 신경세포사멸을 대조군으로 하여 실험하였다. Alpha-2 adrenoceptor 작동제인 clonidine(1-30 μM) 전 처리는 용량의존적으로 L-PDC에 의한 신경세포사멸을 억제하였다. 10 μM clonidine 전처리는 L-PDC에 의한 신경세포사멸을 약 45% 억제하였다. 이러한 clonidine의 L-PDC에 의한 신경사멸 억제작용은 길항제인 yohimbine(10 μM)이나 rauwolscine(10 μM) 전 처리로 현저히 억제되었다. 또한 Gi/o를 억제하는 pertussis toxin(PTX, 10 ng/ml) 22시간 전 처리도 clonidine의 억제작용을 소멸시켰다. 같은 alpha-2 adrenoceptor 작동제인 guanabenz 전 처리 역시 clonidine과 마찬가지로 용량의존적으로 L-PDC에 의한 신경세포사멸을 억제하였으며, guanabenz(10 μM)에 의한 억제작용은 yohimbine이나 PTX 전 처리로 소실되었다. Dopamine D₂ 수용체 작동제인 bromocriptine(1-10 μM) 전 처리 역시 clonidine과 마찬가지로 용량의존적으로 L-PDC에 의한 신경세포사멸을 억제하였으며, bromocriptine(10 μM)에 의한 억제작용은 D₂수용체 길항제인 sulpiride(20 μM)나 PTX 전 처리로 소실되었다. Muscarinic 수용체 작동제인 methacholine(3-30 μM) 전 처리도 용량의존적으로 L-PDC에 의한 신경세포사멸을 억제하였으며, methacholine(10 μM)에 의한 억제작용은 muscarinic 수용체 길항제인 atropine(10 μM) 이나 PTX 전 처리로 소실되었다. GABA_(B) 수용체 작동제인 baclofen(5-20 μM) 전 처리 역시 용량의존적으로 L-PDC에 의한 신경세포사멸을 억제하였으며, baclofen(10 μM)에 의한 억제작용은 GABA_(B) 수용체 길항제인 2-hydroxysaclofen(200 μM) 이나 PTX 전 처리로 소실되었다. Kappa opioid 수용체 작동제인 U50488(0.1-1 μM) 전 처리 역시 용량의존적으로 L-PDC에 의한 신경세포사멸을 억제하였으며, U50488(1 μM)의 억제작용은 opioid 수용체 길항제인 naloxone(10 μM) 이나 PTX 전 처리로 소실되었다. 배지 내 glutamate 농도가 L-PDC 투여 2시간 후에는 약 8배의 증가를 보였으며, 이 배지 내 glutamate 증가작용은 clonidine(10 μM), guanabenz(10 μM), bromocriptine (10 μM), methacholine(10 μM), baclofen(10 μM) 및 U50488(1 μM) 전 처리로 유의하게 억제되었다.
이상의 실험 성적은 배양된 신경세포에서 L-PDC에 의한 신경세포사멸이 Gi/o에 연계된 수용체의 흥분에 의한 배지 내로의 glutamate 유리의 감소에 의해 억제됨을 가리키고 있다. 또한 배양신경세포에서의 L-PDC에 의한 신경세포사멸이 새로운 신경보호약물의 검색체계로 사용될 수 있음을 시사하고 있다.

목차 (Table of Contents)

• 목차
• 국문초록 = 1
• 서론 = 3
• 실험방법 = 5
• 실험성적 = 8
• 고찰 = 22
• 결론 = 25
• 참고문헌 = 27
• Abstract = 29