생물학적동등성시험을 위한 생체시료 분석법 검증 = Bioanalytical Method Validation for the bioequivalence test

국문 초록 (Abstract)

Ⅰ. 제목
생물학적동등성시험을 위한 생체시료 분석법 검증
Ⅱ. 연구개발의 목적 및 필요성
식품의약품안전청에서는 약효동등성시험 관리사업의 일환으로 생물학적동등성 시험을 확대 하고자 시험 대상품목 중 보험급여액이 많고 보험약가 차이가 큰 40여개 성분에 대하여 생물학적 동등성 시험 사업을 착수한 바 있다. 또한 이의 후속조치로서 제 2차 및 3차년도 사업을 시행하기 위하여 오남용의 우려가 있는 항생제，부신피질호르몬제，안전역이 좁거나 보험급여액이 많은 약물 등에 대한 대상성분을 선정하여 생물학적 동등성 시험의 확대 및 효율화를 기하고 있다. 본 연구에서는 생물학적동등성시험시 필수적으로 수행되어야 하는 "생체시료 중의 약물분석법"의 검증과정을 국제적 수준으로 향상시키기 위하여，제 2차년도，3차년도 시행 예정 약물 중 하나인 페플록사신과 세팔렉신의 혈청시료 분석법을 개발하고, 미국 FDA의 "Bioanalytical Method Validation" 가이던스에 따라 분석법 검증과정을 수행하였다. 또한，이 연구로부터 얻어지는 자료를 종합하여 생물학적동등성시험 분석법 검증 시험항목과 기준에 대한 가이던스를 작성 제공하고자 하였다.
Ⅲ. 연구개발의 내용 및 범위
생체 시료중의 약물을 분석하기 위해서는 선택성(selectivity) 및 감도(sensitivity)가 좋은 분석법이 필요하며，분석법의 신뢰성을 확보하는 것도 매우 중요하다. 생체시료 중의 약물 분석에 사용되는 분석법의 타당성 및 신뢰성을 증명하는 과정을 분석법 검증(Bioanaiytical Method Validation)이라고 한다, 분석법 검증에 필수적인 시험항목으로 selectivity(특이성)，accuracy(정확도), precision(정밀도)，recovery (회수율)，calibration curve(검 량선)，LLOQ(정량한계)，linearity(직선성)，stability(안정성) 등을 포함한 여러 인자들이 있다. 본 연구에서는 생물학적동등성시험 수행시 가장 중요한 부분 중의 하나인 생체시료 중의 약물분석법의 신뢰성 있는 검증을 위하여 미국 FDA의 가이던스인 "Bioanaiytical Method Validation"의 시험 항목에 따라 페플록사신과 세팔렉신의 혈청시료 분석을 수행하고 분석법을 검증하였다. 이 시험의 결과로 얻어진 데이터를 정리하여 국내 생물학적동등성시험 중의 분석법 검증과정에 대한 시험항목과 기준을 작성하였다.
IV. 연구개발결과
페플록사신과 세팔렉신의 혈청 중 분석법을 RP-HPLCAJV방법을 이용하여 확립한 후 미국FDA의 Bioanalytical Method Validation 가이던스의 시험항목에 따라 검증하였다. 특이성의 검증을 위하여 6가지 다른 source의 공혈청 및 LLOQ 농도의 표준혈청을 분석하여 비교한 결과 페플록사신과 세팔렉신은 내부표준물질 및 기타 혈청성분들과 잘 분리되었으며 간섭물질의 영향이 없음을 확인하였다. 정확성과 정밀성의 검증은 LLOQ 및 LLOQ를 제외한 3 농도 (LLOQ부근，중앙 부근，검량선의 위쪽 경계부근)에 대해 각각 5번 반복하여 정량하여 평가하였으며 각 농도에서 측정한 일내 및 일간 정밀성과 정확성이 LLOQ를 제외한 농도에서는 15% CV이하이며 LLOQ에서는 20% CV이하임을 확인하였다. 회수율은 추출한 시료의 분석결과를 추출하지 않은 표준용액의 분석결과와 비교하여 평가하였으며 페플록사신과 세팔렉신의 회수율은 각각 76.7%와 81.8%이었다. 검량선을 작성한 결과 페플록사신은 0.1 - 30 ug/mL, 세팔렉신은 0.3-100 ug/mL에서 상관계수 0.99975 이상의 양호한 직선성이 관찰되었으며 검량선의 각 농도에서 정확성 및 정밀성을 평가하여 기준을 만족함을 확인하였다. 정량한계는 신호 대 잡음비를 5 이상으로 하고 정밀성 및 정확성이 20% 이내인 조건을 만족하는 농도로 정하였다. 안정성의 검증은 저농도 (LLOQ의 3배)와 고농도 (검량선 위쪽 경계부분)의 QC시료에 대하여 냉동과 해동을 3회 반복하였을 경우의 안정성， 단기간 및 장기간 보관시의 안정성，stock용액에서의 안정성，자동시료주입기에서의 안정성등을 평가하였다.
V. 연구개발결과의 활용결과 및 계획
본 연구 수행의 결과로 인하여, 생물학적동등성시험의 분석법 검증과정에 대한 합리적인 시험항목과 기준을 제시할 수 있으리라 예상되며, 이를 통한 시험자료 평가의 객관성과 신뢰성이 향상되고 분석법 검중 기준의 국제화에 기여할 수 있을 것이다. 향상된 분석법 검증으로 인하여 생물학적동등성시험의 결과에 대한 객관적 신뢰감이 높아지면，생물학적동등성시험이 활성화 될 것이며 이는 의료비용을 절감하고 의료보험재정의 안정화를 도모하는 데도 기여할 것이다.○ 연구목표 : 본 연구에서는 생물학적동등성시험시 필수적으로 수행되어야 하는 “생체시료 중의 약물분석법”의 검증과정을 국제적 수준으로 향상시키기 위하여, 제 2차년도, 3차년도 시행 예정 약을 중 하나인 페플록사신과 세팔렉신의 혈청시료 분석법을 개발하고, 미국 FDA의 “Bioanalytical Method Validation” 가이던스에 따라 분석법 검증과정을 수행하였다. 또한, 이 연구로부터 얻어지는 자료를 종합하여 생물학적동등성시험 분석법 검증 시험항목과 기준에 대한 가이던스를 작성 제공하고자 하였다.
○ 연구목표 : 페플록사신과 세팔렉신의 혈청 증 분석법을 RP-HPLC八JV방법을 이용하여 확립한 후 미국 FDA의 Bioanalytical Method Validation 가이던스의 시험항목에 따라 검증하였다. 특이성의 검증을 위하여 6가지 다른 source의 공혈청 및 LLOQ 농도의 표준혈청을 분석하여 비교한 결과 페플록사신과 세팔렉신은 내부 표준물질 및 기타 혈장성분들과 잘 분리되었으며 간섭물질의 영향이 없음을 확인하였다. 정확성과 정밀성 의 검증은 LLOQ 및 LLOQ를 제외한 3 농도 （LLOQ부근，중앙부근，검량선의 위쪽 경계부근）에 대해 각각 5번 반복하여 정량하여 평가하였으며 각 농도에서 측정한 일내 및 일간 정밀성과 정확성이 LLOQ를 제외 한 농도에서는 15% CV이하이며 LLOQ에서는 20% CV이하임을 확인하였다. 회수율은 추출한 시료의 분 석 결과를 추출하지 않은 표준용액의 분석결과와 비교하여 평가하였으며 페플록사신과 세팔렉신의 회수율 은 각각 76,7%와 81.8%이었다. 검량선을 작성한 결과 페폴록사신은 0.1 - 30 ug/mL, 세팔렉신은 0,3-100 ug/rri에서 상관계수 0.99975 이상의 양호한 직선성이 관찰되었으며 검량선의 각 농도에서 정확성 및 정 밀성을 평가하여 기준을 만족함을 확인하였다. 정량한계는 신호 대 잡음비를 5 이상으로 하고 정밀성 및 정확성이 20% 이내인 조건을 만족하는 농도로 정하였다. 안정성의 검증은 저능도 （LLOQ의 3배）와 고농도 （검량선 위쪽 경계부분）의 QC시료에 대하여 냉동과 해동을 3회 반복하였을 경우의 안정성, 단기간 및 장1 기간 보관시의 안정성，stock용액에서의 안정성，자동시료주입기에서의 안정성 등을 평가하였다.
○ 연구성과 (응용분야 및 활용범위포함) : 본 연구 수행의 결과로 인하여, 생물학적동등성시험의 분석범 검증과정에 대한 합리적인 시 험항목과 기준을 제시할 수 있으리라 예상되며，이를 통한 시험자료 평가의 객관성과 신뢰성이 향상되고 분석법 검증 기준의 국제화에 기여할 수 있을 것이다, 향상된 분석법 검증으로 인하 여 생물학적동등성 시험의 결과에 대한 객관적 신뢰감이 높아지면，생물학적동등성시험이 활성화 될 것이며 이는 의료비용을 절감하고 의료보험재정의 안정화를 도모하는 데도 기여할 것이다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

This report describes the validation of an analytical method for the determination of pefloxacin and cephalexin in serum using HPLC-UV The method was validated in terms of selectivity, linearity, precision, accuracy, recovery and stability according to "Guidance for Industry - Bioanalytical Method Validation" recommended by the Food and Drug Administration (FDA) of the United States. The assay was linear over the concentration range 0.1 ug/ml to 30 ug/mL for pefloxacin and 0.3 ug/mL to 100 ug/mL with correlation coefficients better than 0.997. The lower limit of quantification (at signal-to-noise ratio S/N=5:1) for pefloxacin and cephalexin were 0.1 ug/ml and 0.3 ug/mL, respectively. Intra- and inter-day coefficients of variance were less than 15% over the entire calibration range except LLOQ. Intra- and inter-day coefficients of variance at LLOQ were less than 20%. The mean recovery of pefloxacin and cephalesin were 76.7 and 81.8%, respectively. The stability of pefloxacin and cephalesin during sample processing and storage were investigated at low and high quality control levels. This method were successfully used for the quantitative determination of pefloxacin and cephlexin in serum samples from the bioequivalence tests.