Role of miR-378a-3p and miR-338-3p in inflammatory bowel disease

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Inflammatory bowel disease (IBD), particularly Crohn’s disease (CD), is characterized by chronic inflammation of the gastrointestinal tract, driven by dysregulated immune responses and altered gene expression. This study investigates the roles of IL-33 and MACC1 in IBD pathogenesis and the therapeutic potential of specific miRNAs from colon epithelial cells of CD patients.
Small RNA sequencing of terminal ileum tissues identified miR-378a-3p and miR-338-3p as differentially expressed miRNAs in inflamed tissues of CD patients. The differential expression of these miRNAs was further validated through qRT-PCR analysis, confirming their significant downregulation in inflamed tissues. Target analysis revealed that miR-378a-3p regulates IL-33, while miR-338-3p targets MACC1, both of which are associated with inflammatory pathways relevant to IBD pathogenesis, suggesting their potential role in modulating inflammatory responses in Crohn's disease. In vivo experiments using a DSS-induced colitis mouse model demonstrated that administering these miRNAs alleviated disease symptoms as assessed by colon length, disease activity index, and immune cell infiltration. Immunohistochemical analyses confirmed a decrease in the expression of IL-33 and MACC1 in miRNA-treated groups. Notably, the treatment with miR-378a-3p, targeting IL-33, significantly reduced MACC1 expression in the colon of mice. In vitro studies with colon epithelial cell lines indicated that IL-33 treatment elevated MACC1 expression at both mRNA and protein levels, as confirmed by qRT-PCR and Western blot analysis, suggesting an interaction between IL-33 and MACC1. RNA-seq analysis revealed a positive correlation between IL-33 and MACC1 expression, further supporting their interconnected roles in CD pathogenesis and relevance in inflammatory pathways.
These findings highlight the therapeutic potential of miR-378a-3p and miR-338-3p in regulating IL-33 and MACC1 to mitigate inflammation in CD pathogenesis. Their application may provide a promising foundation for miRNA- based treatment strategies for CD treatments. Keywords: Crohn’s disease, Inflammatory bowel disease, microRNA, IL-33, MACC1

국문 초록 (Abstract)

염증성 장질환(IBD), 특히 크론병(Crohn’s disease, CD)은 면역 반응의 이상으로 인해 발생하는 만성적인 위장관 염증으로 특징지어진다. 본 연구는 CD 병태생리에 관여하는 IL-33과 MACC1의 역할을 규명하고, CD 환자의 대장 상피세포에서 유래한 특정 miRNA의 치료적 가능성을 탐구하였다.
Small RNA sequencing을 통해 miR-378a-3p와 miR-338-3p가 CD 환자의 염증 조직에서 발현량이 현저히 낮음을 확인하였다. qRT-PCR 분석을통해 추가적으로 검증하였으며 염증 조직에서 발현의 감소가 확인되었다. miR-378a-3p와 miR-338-3p의 타겟인 IL-33과 MACC1 모두 IBD와 연관된 것으로 확인되어 두 microRNA가 크론병에서 염증 반응을 조절하는 데 잠재적인 역할을 할 수 있음을 시사하였다. DSS로 유도된 대장염 마우스 모델을 이용한 in vivo 실험에서 이들 miRNA를 투여한 결과, 대장 길이의 증가, 질병 활동 지수(DAI) 감소, 면역세포 침윤 완화와 같은 질병 증상의 개선이 관찰되었다. 마우스 대장조직의 면역조직화학 분석 결과, miRNA 처리군에서 miR-378a-3p의 표적 유전자인 IL-33과 miR-338-3p의 표적 유전자인 MACC1 발현이 감소하였으며, 특히 IL-33을 표적으로 하는 miR-378a-3p 투여 시 MACC1 발현의 감소도 관찰되었다. In vitro 실험에서 대장 상피세포주에 IL-33을 처리했을 때 MACC1의 mRNA 및 단백질 발현이 증가함을 확인하였으며, RNA-seq 분석을 통해 IL-33과 MACC1 발현 간의 양의 상관관계를 확인했다. 이는 IBD 병태생리에서 IL-33과 MACC1의 연관성과 염증 경로에서의 중요성을 시사한다.
본 연구는 miR-378a-3p와 miR-338-3p가 IL-33과 MACC1을 조절하여 CD 병태생리를 완화할 수 있음을 보였으며, 이들 miRNA는 CD 치료를 위한 새로운 기반을 마련할 수 있는 유망한 전략임을 제시한다.

목차 (Table of Contents)

• 1. INTRODUCTION 1
• 2. MATERIALS AND METHODS 5
• 2.1. Tissue collection 5
• 2.2. RNA isolation, library preparation, and small RNA sequencing 5
• 2.3. Total RNA extraction and quantitative reverse transcription PCR(qRT-PCR) 6
• 2.4. Mouse Model 7
• 2.5. Administration of miRNA mimics, establishment of DSS-induced colitis models and cell preparation 8
• 2.6. Histology and immunohistochemistry (IHC) 10
• 2.7. Flow cytometry 11
• 2.8. Cell culture 11
• 2.9. Western blot analysis 12
• 2.10. Correlation analysis using RNA-seq data 13
• 2.11. Statistical analysis 13
• 3. RESULTS 14
• 3.1. Discovery of miRNAs involved in Crohn's disease 14
• 3.2. Immunohistochemistry (IHC) analysis of MACC1 on tissues from CD patients and healthy controls 20
• 3.3. Therapeutic effects of selected miRNAs in an in vivo mouse IBD model 22
• 3.4. Histological and Immunohistochemical (IHC) analysis of colons from IBD mice 25
• 3.5. Interaction between MACC1 and IL-33 30
• 4. DISCUSSION 33
• REFERENCES 36
• 국문초록 42