MRSA 바이오필름과 항균 펩타이드 haloganan의 상호작용에 관한 연구 = Study on the interaction between MRSA biofilm and antimicrobial peptide haloganan

국문 초록 (Abstract)

항균 펩타이드는 바이오필름 관련 감염에 대처할 수 있는 새로운 항-바이오필름 제제의 유망한 후보로서 간주되어 왔다. 현재까지 항균제로서 항균 펩타이드의 효과를 평가하기 위한 많은 연구가 있었으나 항-바이오필름 작용 메커니즘에 관한 연구는 아직 부족하다. 다른 항생제와 마찬가지로 항균 펩타이드는 부유성 세포를 죽이는 것에 비해 바이오필름 내에 존재하는 박테리아를 죽이는 데 훨씬 더 많은 양과 시간을 필요로 한다. 또한 바이오필름 내 존속성 세균(persister cell)의 존재는 바이오필름의 완전한 제거를 어렵게 할 뿐만 아니라 충분한 양분이 존재하는 환경에 노출되면 재발함으로써 바이오필름 관련 감염의 만성화에 기여한다. 본 연구는 항균 펩타이드의 이러한 항-바이오필름 활성 감소의 원인을 밝히고, persister cell의 존재 여부를 관찰하기 위한 목적으로서 수행되었다. 항균 펩타이드가 methicillin 저항성 황색포도상구균(MRSA) 바이오필름에 처리되었을 때 시간이 지남에 따라 S. aureus 바이오필름의 성장주기를 조절하는 것으로 알려진 세포 외 단백질 분해효소인 aureolysin에 의해 항균 활성이 현저하게 감소된 fragment로 분해되는 것을 발견했다. 따라서 항균 펩타이드는 S. aureus biofilm에 작용하는 동안 aureolysin의 저항을 받는 것으로 확인되었다. 또한, 항균 펩타이드가 처리된 MRSA 바이오필름을 시간에 따라 추가 배양하였을 때 바이오필름의 생존률이 점진적으로 증가함을 관찰함으로써 바이오필름 내 persister cell의 존재를 확인하였다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Antimicrobial peptides have been regarded as promising candidates for novel anti-biofilm agents capable of combating biofilm-related infections. To date, there have been a number of studies to evaluate the effect of antimicrobial peptides as anti-biofilm agents, but studies on the mechanism of action of anti-biofilm are still lacking. Like other antibiotics, antimicrobial peptides require a much greater amount and time to kill bacteria embedded in biofilms than they kill planktonic cells. In addition, the presence of persister cells in the biofilm not only makes it difficult to completely remove the biofilm, but also contributes to chronic biofilm-related infections by recurring when exposed to an environment in which sufficient nutrients exist. This study was conducted as an attempt to clarify the cause of the anti-biofilm activity reduction of antimicrobial peptides and to observe the presence or absence of persister cells. When the antimicrobial peptide is treated on a methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) biofilm, the antimicrobial activity is remarkable by aureolysin, an extracellular protease known to regulate the growth cycle of S. aureus biofilms over time found to break down into reduced fragments. Therefore, it was confirmed that AMP receives resistance from aureolysin while acting on S. aureus biofilm. In addition, it was confirmed that the survival rate of the biofilm gradually increased when the MRSA biofilm treated with the antimicrobial peptide was further cultured while increasing the culture time, thereby confirming the presence of persister cells in the biofilm.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서 론 1
• 1. 바이오필름 1
• 2. MRSA 2
• 3. 항균 펩타이드 3
• Ⅱ. 실험재료 및 방법 5
• 1. 균주 5
• 2. 배지 및 배양 조건 5
• 3. 항생제, 항균 펩타이드 및 시약 5
• 4. 부유성 MRSA의 세포 수 결정 5
• 5 . MRSA 바이오필름 형성 조건 채택 6
• 가. MRSA 바이오필름 형성 6
• 나. Crystal violet staining 7
• 다. WST-1 assay 8
• 라. DNase I을 처리한 colony count assay 8
• 6 . Haloganan의 부유성 MRSA에 대한 항균 활성 조사 9
• 가. Colony count assay 9
• 나. Radial diffusion assay 10
• 7 . Haloganan의 MRSA 항-바이오필름 활성 조사 12
• 가. MRSA 바이오필름 형성 조건 12
• 나. Haloganan의 MRSA 항-바이오필름 활성 조사 12
• 8 . Haloganan 반응액의 MRSA에 대한 항균 활성 조사 14
• 가. Haloganan 반응액 제조 14
• 나. 부유성 MRSA에 대한 항균 활성 조사 14
• 다. MRSA 바이오필름에 대한 항-바이오필름 활성 조사 15
• 9 . Haloganan 반응액의 특성 조사 15
• 가. Haloganan 반응액 제조 15
• 나. Acid-urea PAGE 및 overlay assay 16
• 다. RP-HPLC 분석 17
• 10 . Haloganan 반응액의 HPLC 분획의 특성 조사 18
• 가. Haloganan 반응액의 HPLC 분획 수거 18
• 나. 부유성 MRSA에 대한 항균 활성 조사 18
• 다. MRSA 바이오필름에 대한 항-바이오필름 활성 조사 19
• 라. Acid-urea PAGE 20
• 마. Western blot 분석 20
• 바. MALDI-TOF 질량 분석 및 아미노산 서열 비교 21
• 11 . MRSA 바이오필름 내 persister cell의 관찰 21
• 12 . 통계 분석 22
• Ⅲ. 실험 결과 23
• 1. 부유성 MRSA의 세포 수 결정 23
• 2. 배지 조건별 MRSA 바이오필름 형성 비교 25
• 3. Haloganan의 MRSA에 대한 항균 활성 30
• 가. 부유성 MRSA에 대한 항균 활성 30
• 나. MRSA 바이오필름에 대한 항-바이오필름 활성 33
• 4. Haloganan 반응액의 특성 조사 결과 37
• 가. 부유성 MRSA에 대한 항균 활성 비교 37
• 나. MRSA 바이오필름에 대한 항-바이오필름 활성 비교 37
• 다. Acid-urea PAGE에서의 패턴 변화 39
• 라. RP-HPLC profile에서의 패턴 변화 41
• 5. Haloganan 반응액의 HPLC 분획의 특성 조사 결과 43
• 가. 부유성 MRSA에 대한 항균 활성 비교 43
• 나. MRSA 바이오필름에 대한 항-바이오필름 활성 비교 45
• 다. Acid-urea PAGE에서의 패턴 비교 47
• 라. Western blot 분석 결과 47
• 마. MALDI-TOF 질량 분석 및 아미노산 서열 비교 49
• 6. MRSA 바이오필름 내 persister cell 관찰 결과 52
• Ⅳ. 고 찰 54
• Ⅴ. 결 론 58
• 참고문헌 59
• 영문초록 65