순환기질환(고지혈증) 진단용 재조합 항체 단백질의 생산 및 분리정제 기술 개발 . 제2단계 최종보고서 = Process development for production and purification of immunodiagnostic recombinant antibodies for serum apolipoprotein analyses

목차 (Table of Contents)

• 목차
• 요약문(SUMMARY) = 3
• 제1장 서론(Introduction) = 25
• 제2장 국내외 기술개발 현황(Status of the Art) = 31
• 제1절 국외 기술개발현황 = 31
• 제2절 국내 기술개발현황 = 33
• 제3절 조사연구개발사례에 대한 평가 = 34
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과(Experiments and Results) = 37
• 제1절 실험재료(Materials) = 37
• 제2절 실험방법(Methods) = 37
• 2.1. cDNA 합성(cDNA synthesis) = 37
• 2.2. 연쇄중합반응에 의한 cDNA의 합성(PCR) = 38
• 2.3. 증폭시킨 cDNA의 클로닝(Cloning of PCR product) = 38
• 2.4. DNA의 염기서열 분석(DNA sequencing) = 38
• 2.5. 재조합 항체 중사슬과 경사슬 유전자의 발현 벡터 제조(Fab expression vectors construction) = 39
• 가. E. coli periplasm에서의 발현을 위한 벡터 구성 = 39
• 나. E. coli cytoplasm에서의 발현을 위한 벡터 구성 = 40
• 2.6. 재조합 항체 중사슬과 경사슬의 발현 및 확인(Analysis of Fab chains expression) = 40
• 2.7. 불용성으로 발현된 재조합 중사슬과 경사슬의 부분 분리(Purification of Fab inclusion bodies) = 42
• 2.8. 부분 분리된 재조합 중사슬과 경사슬의 변성(Solubilization of Fab inclusion bodies) = 43
• 2.9. 변성된 중사슬과 경사슬의 리폴딩(Refolding of Fab) = 43
• 가. mAbB9, mAbB23, mAbB55의 리폴딩 = 43
• 나. mAbA34의 리폴딩 = 44
• 2.10. 단일사슬항체(single-chain Fv) 발현 벡터 제조(Single-chain Fv expression vector construction) = 44
• 2.11. 재조합 단일사슬항체의 발현 및 확인(Analysis of ScFv expression) = 46
• 2.12. 불용성으로 발현된 재조합 단일사슬항체의 부분 분리(ScFv inclusion bodies isolation) = 46
• 2.13. 부분 분리된 재조합 단일사슬항체의 변성(Denaturation and solubilization of ScFv) = 47
• 가. mAbB9, mAbB23 = 47
• 나. mAbA34 = 47
• 2.14. 변성된 단일사슬항체의 리폴딩(Refolding of ScFv) = 47
• 2.15. 리폴딩된 단일사슬항체의 분리(Purification of refolded ScFv) = 48
• 2.16. 리폴딩된 단일사슬항체의 특이성 및 활성 점검(Analyses of specificity and activity of ScFv) = 48
• 2.17. Fab와 단일사슬항체에 대한 항혈청 준비(Preparation of antiserum against Fab and ScFv) = 49
• 2.18. Apo(a)의 kringle V 및 protease 영역의 클로닝을 위한 프라이머 구성전략(Primer design for cloning of apo(a) kringle V and protease domains) = 50
• 2.19. 인간 혈장 아포지단백질(a)에 대한 효소면역분석법 개발(Development of apo(a) ELISA using polyclonal Ab) = 50
• 가. 다중클론 항체의 생산 = 50
• 나. 항 apo(a)에 대한 항체의 분리정제 = 51
• 다. 항체 친화성 column을 이용한 인간 혈장내의 Lp(a)의 분리 = 51
• 라. 항체의 효소에의 결합 = 52
• 마. Antibody-HRP conjugate의 분리정제 = 52
• 바. 샌드위치 효소면역분석법 = 52
• 제3절 인간 혈장 아포지단백질에 대한 재조합 항체 유전자의 미생물에서의 발현(Expression in E. coli of the heavy and light chains of anti-apolipoprotein antibodies) = 53
• 3.1. 재조합 항체의 클로닝 및 염기서열 분석(Cloning and sequencing of the heavy and light chain cDNAs of MabB55) = 53
• 3.2. 인간 혈장 아포지단백질에 대한 재조합 항체 유전자의 대장균 periplasm에서의 발현(E. coli periplasmic expression of anti-apolipoprotein antibodies) = 56
• 가. 인간 혈장 아포지단백질 B-100에 대한 단일클론 항체 mAbB9 유전자의 발현 = 56
• 나. 인간 혈장 아포지단백질 A-Ⅰ에 대한 단일클론 항체 mAbA34 유전자의 발현 = 56
• 3.3. 인간 혈장 아포지단백질에 대한 재조합 항체 유전자의 대장균 세포내 발현(E. coli cytoplasmic expression of anti-apolipoprotein antibodies) = 58
• 가. Fab 중사슬과 경사슬의 발현 = 58
• 나. 단일사슬항체의 발현 = 66
• 제4절 인간 혈장 아포지단백질에 대한 재조합 항체 균주배양 기술(Culture conditions for the strains expressing the recombinant antibodies) = 69
• 4.1. Fab 중사슬과 경사슬의 내재 균주배양(Cultures of cells for Fab expression) = 69
• 가. 인간 혈장 아포지단백질 B-100에 대한 단일클론항체 mAbB23 균주 배양 = 74
• 나. 인간 혈장 아포지단백질 B-100에 대한 단일클론항체 mAbB9 균주 배양 = 74
• 다. 인간 혈장 아포지단백질 B-100에 대한 단일클론항체 mAbB55 균주 배양 = 74
• 라. 인간 혈장 아포지단백질 A-1에 대한 단일클론항체 mAbB34의 균주 배양 = 75
• 4.2. 단일사슬항체(single-chain Fv)의 발현(Cultures of cells for ScFv expression) = 76
• 가. 인간 혈장 아포지단백질 B-100에 대한 단일클론항체 mAbB23 균주 배양 = 76
• 나. 인간 혈장 아포지단백질 B-100에 대한 단일클론항체 mAbB9 균주 배양 = 76
• 다. 인간 혈장 아포지단백질 A-1에 대한 단일클론항체 mAbB34 균주 배양 = 76
• 제5절 인간 혈장 아포지단백질에 대한 재조합 항체 분리정제 기술(Isolation and purification of anti-apolipoprotein recombinant antibodies) = 77
• 5.1. 발현된 불활성 단일클론항체의 부분분리(Inculsion bodies isolation) = 77
• 가. 발현된 불활성 단일클론항체 Fab 중사슬과 경사슬의 부분분리 = 77
• 나. 발현된 불활성 단일클론항체의 부분분리 = 78
• 5.2. 부분분리된 불활성 단일클론항체의 변성(Denaturation of inclusion bodies) = 80
• 가. 부분분리된 불활성 단일클론항체 Fab 중사슬과 경사슬의 변성 = 83
• 나. 부분분리된 불활성 단일사슬항체의 변성 = 84
• 5.3. 변성된 불활성 단일클론항체의 리폴딩(Refolding) = 85
• 가. 변성된 불활성 단일클론항체 Fab 중사슬과 경사슬의 리폴딩 = 85
• 나. 변성된 불활성 단일사슬항체의 리폴딩 = 89
• 5.4. 리폴딩된 활성단일클론항체의 정제 및 특성(Purification and characterization of refolded products) = 89
• 가. 리폴딩된 활성 단일클론항체 Fab 중사슬과 경사슬의 정제 및 특성 = 90
• 나. 리폴딩된 활성 단일사슬항체의 정제 및 특성 = 93
• 제6절 인간 혈장 아포지단백질(a)에 대한 다중클론항체 생산(Production of polyclonal antibodies against apo(a) = 107
• 6.1. 재조합 아포지단백(a) 항원 생산(Production of recombinant apo(a) antigen) = 107
• 가. 올리고 뉴클레오타이드의 합성, 접합 및 운반체에 클로닝 = 107
• 나. 합성 apo(a)VP 유전자의 대장균내에서의 발현 = 111
• 6.2. 인간 혈장 아포지단백질(a)에 대한 다중클론항체 생산(Production of polyclonal antibodies against human apo(a)) = 115
• 가. 재조합 apo(a)에 대한 항체의 특이도분석 = 115
• 나. apo(a)에 대한 항체를 이용하여 인간의 혈액 내 Lp(a)의 분리방법 = 115
• 6.3. 인간 혈장 아포지단백질(a)에 대한 효소면역 분석법 개발(Development of ELISA for human apo(a)) = 120
• 제7절 인간 혈장 아포지단백질 B-100과 A-Ⅰ에 대한 진단키트 제조(Production of immunodiagnostic kits for the measurement of apo B-100 and apo A-Ⅰ) = 123
• 7.1. 항원 및 항체 생산(Antigen and antibody production) = 123
• 7.2. Apo B100 및 apo A-Ⅰ 측정 시약의 구성 조건 확립(Optimization of kit composition) = 125
• 가. apo B100 측정 키트 = 127
• 나. apo A-Ⅰ 측정 키트 = 127
• 7.3. 성능실험(Performance tests) = 127
• 가. 특이성 = 127
• 나. 감도 및 측정범위 = 128
• 다. 재현성 = 128
• 7.4. 타제품과의 상관성(R) 시험(Comparison with other commercial kits) = 131
• 가. 같은 방법을 사용하는 시약과의 상관성 = 131
• 나. 서로 다른 방법을 사용하는 시약과의 상관성 = 131
• 7.5. 보건복지부 허가사항(Acquisition of governmental permission) = 132
• 제4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도(Achievement and Contribution) = 133
• 제5장 연구개발결과의 활용계획(Application of the Results) = 143
• 제6장 참고문헌(References) = 145
• 위탁과제(Sub) Ⅰ = 153
• 위탁과제(Sub) Ⅱ = 167
• 위탁과제(Sub) Ⅲ = 183
• 위탁과제(Sub) Ⅳ = 219