Enterococcus faecalis M157 KACC81148BP를 활용한 유청 생물전환 물질의 치주염 개선효능 연구 = Periodontitis-relieving effect of whey bioconversion products by Enterococcus faecalis M157 KACC81148BP

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Whey is a by-product produced in the cheese manufacturing process, and the amount of whey production is 10 times more than that of cheese. Recently various functions have been proven, and it is used as a food additive and health promoting supplement. By inducing the hydrolysis of whey protein bioconversion through microbial fermentation, it can release bioactive compounds from the precursor protein. In particular, it is known that milk-derived bioactive peptides can exhibit various physiological functions such as antihypertension, immune regulation, antioxidant, and antithrombosis. Periodontal disease is the most common disease that occurs in the oral cavity, and periodontitis is a major cause of tooth loss in adults. In order to alleviate the side effects by antibiotics and physical therapies, interest in natural substitutes is increasing. Therefore, in this study, the efficacy of relieving periodontitis was confirmed by utilizing the whey bioconversion products. The whey bioconversion products was prepared using the lactic acid bacteria Enterococcus faecalis M157 KACC81148BP isolated from raw milk, and bioconversion products supplemented with bacteriocin active fraction was prepared together to confirm the efficacy of the whey bioconversion products. In in vitro experiments, the antimicrobial effect on periodontal pathogens, antioxidant activity, cytotoxicity, and hemolytic properties of the E. faecalis whey bioconversion products were confirmed. In an in vivo experiment, E. faecalis whey bioconversion products were administered orally and dispensed to the site ligatured with the lower right maxillary first molar tooth for 8 weeks in periodontitis animal models. Histopathologicalal analysis and micro-CT analysis of gingival tissue were performed, and the expression levels of inflammation and oxidative stress-related proteins in gingival tissue and colon were confirmed through Western blot to confirm the effect of relieving periodontitis. In the antimicrobial effect on periodontal pathogens, whey bioconversion products prepared using E. faecalis M157 KACC81148BP (M157) and the bioconversion products supplemented with bacteriocin active fraction (M157+) exerted antimicrobial effect on Aggregatibacter actinomycetemcomitans and Fusobacterium nucleatum. In antioxidant activity test, M157 and M157+ showed no significant difference with ascorbic acid used as a positive control. Cytotoxicity was not shown in HT-29 cells, and it was confirmed that there was no hemolytic properties. After the treatment of the whey bioconversion products and the whey bioconversion products supplemented with bacteriocin active fraction to Wistar rats that induced periodontitis, as a result of histopathologicalal analysis, epithelial proliferation and inflammatory cell infiltration occurred in the PE group. Compared to the PE group, it was confirmed that epithelial proliferation and invasion of inflammatory cells were expressed lower in the PE+M157 and PE+M157+ groups administered with the whey bioconversion products and the whey bioconversion products supplemented with bacteriocin active fraction. As a result of micro-CT analysis, bone volume/total volume (BV/TV), bone surface/bone volume (BS/BV), and bone loss volume were inspected in the treated group. In the PE+M157+ group administered with the bioconversion products supplemented with bacteriocin active fraction, BV/TV was significantly increased and bone loss volume was significantly decreased compared to the PE group. BS/BV was significantly decreased in PE+M157, PE+M157+ groups compared to the PE group. As a result of the expression levels of proteins related to inflammation (TNF-α, IL-6, IL-10) and oxidative stress (SOD1, CAT, GPx-1) through Western blot in gingival tissue and colon, anti-inflammatory and antioxidant effects were shown in the PE+M157 and PE+M157+ groups. Therefore, based on the results of this study, the whey bioconversion products prepared with E. faecalis M157 KACC81148BP has shown the relieve effect on periodontitis.

국문 초록 (Abstract)

유청은 치즈 제조 공정에서 생성되는 부산물로, 치즈 생산량의 10배의 유청이 생산되고 있으며 최근 다양한 기능성이 입증되어 식품 첨가물, 건강기능식품으로 활용되고 있다. 미생물 발효를 통한 생물전환으로 유청 단백질의 가수분해를 유도하여 전구 단백질로부터 생리활성물질을 방출할 수 있다. 특히 우유 유래 생리활성 펩타이드는 항고혈압, 면역조절, 항산화, 항혈전 등 다양한 생리적 기능성을 보인다고 알려져 있다. 치주질환은 구강 내 발생하는 가장 흔한 질환이며 치주염은 성인 치아 손실의 주원인으로, 항생제 및 물리적 치료의 부작용을 극복하기 위해 이를 대체할 천연물에 관한 관심이 증가하고 있다. 따라서 본 연구에서는 유청 생물전환 물질 내 bacteriocin active fraction을 활용하여 치주염의 개선효능을 확인하고자 하였다. 원유에서 분리한 젖산균 Enterococcus faecalis M157 KACC81148BP를 이용하여 유청 생물전환 물질을 제조하고 생물전환 물질 내 bacteriocin active fraction의 효능을 확인하기 위해 bacteriocin active fraction을 추가한 물질을 함께 제조하였다. In vitro 실험에서 유청 생물전환 물질의 구강 유해 세균에 대한 항균효과, 항산화능, 세포독성, 용혈성을 확인하였다. In vivo 실험에서 우측 아래 제1 대구치를 결찰한 치주염 동물모델에 8주간 생물전환 물질 및 물질 내 bacteriocin active fraction을 경구투여 및 유발 부위에 도포하였다. 치주조직의 병리학적인 분석과 micro-CT 분석을 진행하고 치주조직과 대장에서의 염증 및 산화 스트레스 관련 단백질 발현량을 Western blot을 통해 확인하여 치주염의 개선 효과를 확인하였다. E. faecalis M157 KACC81148BP를 활용하여 제조한 유청 생물전환 물질 및 bacteriocin active fraction을 추가한 생물전환 물질의 구강 유해 세균에 대한 항균효과 실험에서 두 가지 모두 Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Fusobacterium nucleatum 에 대해 항균력을 보였으며, 항산화능 실험에서는 양성 대조군으로 활용한 ascorbic acid와 유의차를 보이지 않는 높은 값을 보였다. HT-29 세포의 생존율을 확인하였을 때 대조군과 유의적 차이가 없어 세포독성이 없었으며, 용혈성이 없는 것을 확인하였다. 치주염을 유발한 Wistar rat에 8주간 유청 생물전환 물질(M157)과 bacteriocin active fraction을 첨가한 유청 생물전환 물질(M157+)을 처리하였다. 치주조직의 병리학적인 분석을 진행한 결과 대조군에서 상피증식 및 염증세포의 침윤이 발생하였으며 대조군보다 유청 생물전환 물질 및 bacteriocin active fraction을 추가한 유청 생물전환 물질을 투여한 PE+M157 군, PE+M157+ 군에서 상피증식과 염증세포의 침윤이 더 낮게 발현되는 것을 확인하였다. micro-CT 분석 결과 PE+M157+ 군에서 총 부피당 골 부피(BV/TV)가 대조군과 비교하여 유의적으로 증가하였으며 골 소실량(bone loss volume)이 유의적으로 감소하였다. 골 부피당 표면적(BS/BV)의 경우 대조군과 비교하여 PE+M157 군, PE+M157+ 군에서 유의하게 감소하였다. 치주조직과 대장에서의 Western blot을 통한 염증(TNF-α, IL-6, IL-10) 및 항산화 효소 활성 지표(SOD1, CAT, GPx-1) 관련 단백질 발현량을 확인한 결과 대조군과 비교하여 PE+M157 군, PE+M157+ 군에서 항염증 및 항산화 효과를 보였다. 따라서 본 연구의 결과를 바탕으로 E. faecalis M157 KACC81148BP로 제조한 유청 생물전환 물질 내 bacteriocin active fraction은 치주염 개선효능이 우수한 것으로 판단하였다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서론 = 1
• Ⅱ. 문헌 고찰 = 3
• 1. 유청(Whey) = 3
• 1) 정의 = 3
• 2) 연구 및 활용현황 = 3
• 2. 생리활성물질(bioactive compounds) = 4
• 1) 정의 = 4
• 2) 연구 및 활용현황 = 6
• 3. 치주염(Periodontitis) = 8
• 1) 정의 = 8
• 2) 현황 = 9
• Ⅲ. 재료 및 방법 = 12
• 1. 유청 생물전환 물질의 제조 = 12
• 2. 유청 생물전환 물질의 안전성 및 효능 평가 = 14
• 1) 구강 유해 세균에 대한 항균효과 확인 = 14
• 2) 항산화능 확인(DPPH 라디칼 소거능) = 15
• 3) 세포독성 확인(MTT Assay) = 16
• 4) 용혈성 확인 = 17
• 3. 동물모델을 이용한 치주염 개선 효과 확인 = 18
• 1) 동물실험 디자인 = 18
• 가) 투여 물질의 제조 = 18
• 나) 실험동물 및 사육조건 = 18
• 다) 치주염 유발 및 시료 투여 = 19
• 2) 체중 = 21
• 3) 장기 분리 = 21
• 4) 치주조직의 병리학적 분석 = 22
• 5) 치주조직의 Micro-CT 분석 = 22
• 6) 치주조직과 대장 조직의 단백질 발현량 분석 = 23
• 가) 단백질 추출 및 정량 = 23
• 나) Western blot 분석 = 24
• 4. 통계학적 분석 = 26
• Ⅳ. 결과 및 고찰 = 27
• 1. 유청 생물전환 물질의 안전성 및 효능 = 27
• 1) 구강 유해 세균에 대한 항균효과 = 27
• 2) 항산화능(DPPH 라디칼 소거능) = 29
• 3) 세포독성검사(MTT Assay) = 31
• 4) 용혈성 = 33
• 2. 동물모델을 이용한 치주염 개선 효과 확인 = 36
• 1) 체중 = 36
• 2) 치주조직의 병리학적 분석 = 38
• 3) 치주조직의 Micro-CT 분석 = 41
• 4) 치주조직과 대장 조직의 단백질 발현량 분석 = 45
• Ⅴ. 요약 및 결론 = 61
• Ⅵ. 참고문헌 = 64
• APPENDICES = 78
• ABSTRACT = 79