Protective effects of prasiola japonica ethanol extract in a menopause model : multi-system effects on immune modulation, muscle, and bone

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Menopause results in a long-term estrogen drop because of cessation of ovarian function, which leads to disruption of balance in multiple systems including immune modulation, muscle maintenance, and bone strength. The imbalance elevates the risk of chronic health problems as women age. Due to its potential side effects associated with prolonged use of conventional hormone therapy, interest in safer alternatives that can protect various physiological systems simultaneously has arisen. With the advent of natural materials as potential candidates, ethanol extract of Prasiola japonica, which is an edible freshwater green alga consumed traditionally in East Asia was investigated in a menopause model. The menopause model was established by surgically removing ovaries (OVX) from mice to induce estrogen deficiency. After a recovery period, the animals received the Prasiola japonica ethanol extract (Pj-EE) or isoflavone, a phytoestrogen, ad libitum for 9 weeks. Estrogen deficiency and Pj-EE effects on the body were examined through analysis in several physiological systems. After ovariectomy, serum estradiol levels dropped, and subsequently reproductive hormone feedback system was disrupted. Body weight increased steadily over the experiment. Moreover, immune system balance became unstable, and muscle fibers shrank in size and shape, while trabecular bone was structurally deteriorated. Pj-EE supplementation counteracted most OVX-induced complications. The body weight increase slowed down, while estradiol recovery helped partly stabilize hormone regulation. Immune cell population changes caused by OVX showed improvement and started returning toward normal balance. In skeletal muscle, the extract treatment preserved fiber size more effectively and made fiber shapes more regular. Additionally, the disturbance in muscle water balance was corrected, confirming successful reduction of muscle atrophy. In bone tissue, trabecular bone area showed partial recovery in comparison with untreated OVX group. At the molecular level, Pj-EE reduced the expression of genes related to osteoclast activity, including a transcription factor involved in osteoclast differentiation (NFATc1), a fusion-related gene required for multinucleated cell formation (ATP6v0d2), and enzymes associated with bone matrix degradation (CTSK). Taken together, these findings suggest that Pj-EE can target several adverse effects of estrogen deficiency in immune, muscle, and bone systems. Therefore, this extract may be considered a dietary approach to support health during menopause.

국문 초록 (Abstract)

폐경은 난소 기능의 상실로 월경이 영구적으로 중단되는 생리적인 변화로, 에스트로겐 분비가 감소하고 생식 기능이 종료되는 시기이다. 에스트로겐 감소는 면역계, 근육, 골격계 등 전신 시스템에 영향을 미치며 증상이 심한 경우에는 삶의 질이 크게 저하되어 치료가 필요하다. 폐경 증상 치료에 가장 널리 사용되는 호르몬 대체 요법은 효과적이나 장기 사용 시 유방암, 심혈관질환 등의 위험을 높인다는 보고가 있다. 이러한 한계점으로 인해 장기간 투여에도 상대적으로 안전할 것으로 기대되는 식이 유래 또는 자연 유래 물질을 이용한 비호르몬성 치료법 개발에 대한 관심이 높아지고 있다. 따라서 본 연구는 동아시아에서 섭취하고 있는 식용 담수 녹조류인 민물김 (Prasiola japonica)의 에탄올 추출물 (Pj-EE)을 폐경 모델에서의 다중 생리계의 보호 효능을 평가하였다. 폐경 모델은 에스트로겐 결핍을 위해 마우스의 양측 난소를 절제하여 확립하였으며, 회복 기간 후 마우스에 Pj-EE (25, 50 mg/kg) 또는 식물성 에스트로겐인 이소플라본 (50 mg/kg)을 9주 동안 자유롭게 섭취하도록 했다. 다중 생리계의 변화를 분석한 결과, 난소 절제 (OVX)로 혈중 에스트로겐이 감소하는 것이 확인되었으며 이에 따라 생식 호르몬이 보상적으로 증가하고 체중이 지속적으로 증가하였으며 면역 항상성이 붕괴되었다. 또한 근육 위축이 일어났으며, 뼈 면적이 감소하였다. 이러한 결과들을 Pj-EE가 부분적으로 완화했다. Pj-EE 섭취한 군에서 체중 증가가 억제되었고 혈중 에스트로겐이 회복되면서 생식 호르몬 불균형도 완화되었다. 면역 세포들의 분포를 분석했을 때, Pj-EE가 OVX 군에서 증가한 Th17/Treg 비율, CD8 T 세포, B 세포를 SHAM 대조군과 유사한 수준으로 낮추고, 감소한 호중구의 상대적 비율은 증가시킴으로써 면역 항상성을 회복시켰다. 근육에서는 Pj-EE가 난소 절제로 위축된 근섬유를 되돌리는 것을 근섬유의 면적 증가와 근섬유 형태 (원형도, 완전도) 복구, 근육 수분 함량 증가를 통해 확인했다. 그리고 뼈 조직에서 해면골 면적 감소가 Pj-EE에 의해 부분적으로 완화되었다. 추가적으로 분자 수준에서 Pj-EE의 골 보호 효과를 더 자세하게 연구한 결과, Pj-EE가 파골세포의 수와 활성을 나타내는 TRAP 염색이 크게 감소하며 파골세포 분화의 핵심 전사인자인 NFATc1과 골 흡수를 일으키는 ATP6v0d2와 CTSK의 발현이 감소하는 것을 통해 Pj-EE가 파골세포의 분화를 효과적으로 억제하며 이로써 뼈의 밀도를 유지할 수 있게 한다는 것을 간접적으로 확인했다. 이러한 연구 결과를 종합하면, Pj-EE는 에스트로겐 결핍으로 인한 면역, 근육, 뼈의 복합적인 증상을 동시에 완화하여, 폐경기 건강 관리를 위한 다중 표적 식품 유래 소재로서의 가능성을 보여준다.

목차 (Table of Contents)

• 1. Introduction 1
• 2. Materials and Methods 5
• 2.1 Materials 5
• 2.2 Animals 6
• 2.3 OVX animal model 6
• 2.4 Prasiola japonica ethanol extract preparation 7
• 2.5 Serum biochemical analysis 8
• 2.6 Enzyme linked immunosorbent assay 8
• 2.7 Flow cytometry 10
• 2.8 Eosin staining 13
• 2.9 Morphometric analysis of skeletal muscle fiber 13
• 2.10 Muscle wet to dry ratio analysis 14
• 2.11 Micro-CT analysis 15
• 2.12 Cell culture 15
• 2.13 Cell viability assay 15
• 2.14 Tartrate-Resistant Acid Phosphatase (TRAP) staining 16
• 2.15 Quantitative real-time PCR analysis 17
• 2.16 Statistical analysis 19
• 3. Results 20
• 3.1 Pj-EE attenuates OVX-induced body weight gain and hormonal imbalance 20
• 3.2 Pj-EE recovers OVX-induced immune dysregulation 25
• 3.3 Pj-EE mitigates OVX-induced skeletal muscle atrophy 31
• 3.4 Pj-EE partially recovers OVX-induced bone loss 37
• 3.5 Pj-EE inhibits RANKL-induced osteoclastogenesis in RAW 264.7 cells 41
• 4. Conclusion and Discussion 47
• References 52
• 국문요약 (초록) 55