Profiling of Mouse Brain Proteome through Developing Multi-fractional Separation Techniques

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

This study reports multiple fractionation separation strategies prior to MS/MS analysis using LTQ mass spectrometer as proteomic approach for analyzing brain tissue. The complexity of the brain presents one of the most significant challenges in proteome analysis. Therefore it has great interest to extract and analyze. Prefractionated brain tissue samples with the method of J. Klose were analyzed by SCX fractionation coupled with reversed phase LC-MS/MS analysis or by OFFGEL fractionation in combination with reversed phase LC-MS/MS analysis. As a result, a total of 20 393 different peptides from the mouse brain sample were confidently identified, covering 3436 proteins (FDR<1%) using OFFGEL and SCX fractionation and a total of 1995 and 434 proteins were identified exclusively from the peptide samples by OFFGEL and SCX fractionation. Approximately 32% of the identified proteins with gene ontology annotations were membrane proteins. Also, we identified 128 proteins related to brain diseases such as Alzheimer’s diseases, Huntington’s diseases, and Parkinson’s diseases. These multiple fractionation separation strategies prior to MS/MS analysis using a LTQ mass spectrometry are the efficient method for brain tissue and may have broad applications for proteomic analyses of finding the mechanisms of neurological diseases and the aging process. Furthermore, it can readily be applies to screen for candidate biomarkers of neurological diseases.

국문 초록 (Abstract)

이 연구에서는 쥐의 뇌 조직을 프로테오믹스 방법으로 분석하기 위해 이상적인 다중 구획 분리 전략을 LTQ 질량분석기를 사용하여 분석하였다. 뼈, 피부, 근육 등 몸의 모든 조직은 같은 종류의 세포를 가지고 있지만 뇌는 뉴런을 비롯한 여러 종류의 세포로 유지되고 있다. 이러한 뇌 조직의 복잡성은 프로테오믹스 분야에서 정확하게 보다 많은 단백질을 추출하기 위해 도전해야 할 가장 중요한 과제 중 하나이며, 이를 위해 단백질의 추출과 분석기술이 중요하다. 이러한 이유로 기존에 2-DE를 비롯한 여러 가지 프로테옴 분석방법과 조직 추출방법들이 이루어졌다. 이 연구에서는 J. klose에 의한 방법으로 마우스 뇌 조직 샘플을 더 많이 구획화하여 단백질 추출의 효율성을 높이고, SCX 분리 방법과 역상 컬럼을 이용한 LC-MS/MS 분석 또는 OFFGEL 분리 방법과 역상 컬럼을 이용한 LC-MS/MS 분석을 결합하여 더 많은 단백질을 분석하였다.
그 결과 OFFGEL 분리 방법과 SCX 분리 방법을 이용한 각각의 실험에서 1995개 434개의 단백질이 발견되었으며, gene ontology (GO) annotation tool로 분석하여 동정된 단백질 중 32%가 막 단백질인 것으로 발견되었다. 또한 알츠하이머 병과 헌팅턴 병, 파킨슨씨 병과 같은 뇌 질환 관련된 단백질들은 128개로 동정되었다. 이러한 LTQ 질량분석기를 이용한 MS/MS분석과 함께 수행되는 다중 구획 분리 전략은 복잡한 뇌 조직 분석을 위해 효과적인 방법이며, 또한 더 나아가 뇌 질환과 노화 과정에 대한 메커니즘을 찾거나 뇌 질환 관련 표지자를 찾기 위한 방법으로도 폭넓게 적용될 수 있다.

목차 (Table of Contents)

• Contents 1
• List of Figures 2
• 1.INTRODUCTION 4
• 2.MATERIALS AND METHODS 7
• 2.1 Mouse brain tissue 7
• 2.2 Cell prefractionation of hemisphere in mouse brain tissue 8
• 2.3 Trypsin digestion 8
• 2.4 OFFGEL fractionation 9
• 2.5 Strong cation exchange fractionation 10
• 2.6 7T LTQ-FT 10
• 2.7 Data analysis 11
• 3.RESULTS AND DISCUSSION 13
• 3.1 Cell prefractionation of mouse brain tissue by the method of J.klose 13
• 3.2 Peptide separation by OFFGEL fractionation 16
• 3.3 Peptide separation by SCX fractionation 18
• 3.4 LC-MS/MS analysis coupled with multi-fractional separation techniques and Data analysis 19
• 3.5 Gene ontology 25
• 3.6 Neurological disease related proteins 27
• 3.7 The new proteins searched with mouse DB 29
• 4.CONCLUSION 32
• 5.REFERENCES 34
• ABSTRACT* 41
• 국문 초록 43