혈소판 풍부 혈장 전처치 지지체에서 골모세포-연골세포 공배양이 골-연골 경계부 치유에 미치는 영향 = Effect of Osteoblast-Chondrocyte Co-culture in Platelet-Rich Plasma-Pretreated Scaffolds on Bone-Cartilage Interface Healing

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Effective biological integration of the bone-cartilage interface remains a significant challenge in the field of orthopedics. Existing clinical and tissue engineering approaches have limitations in fully reconstructing the organic connection between these two tissues, which possess distinct physical properties. Therefore, this study aimed to develop an in vivo implantable tissue engineering scaffold by establishing an osteoblast-chondrocyte co-culture system based on Poly-lactic-co-glycolic-acid (PLGA) scaffolds pre-treated with platelet-rich plasma (PRP). We sought to investigate whether this scaffold promotes healing and integration of the bone-cartilage interface and to determine if PRP functions as a biological adjuvant to enhance the co-culture process and integration capability.
Chondrocytes and osteoblasts were co-cultured on PLGA scaffolds, and cell culture outcomes and healing efficacy were compared based on the application of PRP. For in vitro evaluation for the co-culture process, cell adhesion and proliferation rates were measured. Phenotype maintenance was verified using reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), and microstructural distribution was confirmed using scanning field emission electron microscopy (SEM) and fluorescence microscopy. To assess the healing efficacy of the co-culture scaffolds, in vivo evaluations were conducted. A gap-mimic construct consisting of bone, the scaffold, and cartilage was assembled and implanted subcutaneously in BALB/c-nude mice. Specimens were harvested at 4 and 8 weeks post-implantation to analyze macroscopic bonding, histological cellular invasion, and quantitative attachment rates. Additionally, the PRP-treated group was compared with the non-treated group during both the co-culture process and the scaffold healing efficacy evaluation to further confirm the role of PRP as a biological adjuvant.
In vitro analysis revealed that co-cultured osteoblasts and chondrocytes adhered and proliferated on PLGA scaffolds while maintaining their phenotypes. PRP treatment further increased chondrocyte proliferation by 115% and osteoblast proliferation by 20%. In vivo analysis showed that cell-seeded scaffolds exhibited significantly higher attachment rates at the bone-cartilage interface compared to acellular controls. Furthermore, they demonstrated active tissue integration, characterized by interdigitation and cellular invasion between bone-cartilage interface, beyond simple physical contact. Notably, the PRP-treated group showed the highest attachment rate (82.3%) and the highest frequency of cellular invasion (5/6 specimens) at 8 weeks post-implantation. Cellular invasion was observed as early as 4 weeks in the PRP group, indicating that PRP accelerates the healing process of the interface.
In conclusion, this study confirmed that PLGA scaffolds containing co-cultured chondrocytes and osteoblasts with preserved their own phenotype can promote bone-cartilage interface integration. Cell-seeded scaffolds demonstrated superior results in both attachment rates and cellular invasion frequency compared to acellular scaffolds, and the combined use of PRP enhanced these effects. PRP appears to play an adjunctive role in improving initial cell adhesion and proliferation and accelerating histological integration at the interface. These findings suggest that a scaffold-based approach combining co-cultured cells and PRP serves as a promising bioengineering strategy for bone-cartilage interface regeneration.

국문 초록 (Abstract)

골-연골 경계부의 효과적인 생물학적 통합은 정형외과 영역에서 여전히 해결하기 어려운 과제이다. 기존의 임상적 혹은 조직공학적 치료법들은 상이한 물성을 지닌 두 조직 간의 유기적인 연결을 완벽히 재구성하지 못하는 한계가 있다. 이에 본 연구는 자가혈소판풍부혈장(platelet-rich plasma, PRP) 전처치가 이루어진 Poly-lactic-co-glycolic-acid (PLGA) 지지체 기반의 골모세포-연골세포 공배양 체계를 구축하여 생체 내 이식가능한 조직공학적 지지체를 개발하는 것을 목표삼아, 상기 지지체가 골-연골 경계면의 치유 및 통합을 촉진하는지 여부 및 자가혈소판풍부혈장이 공배양 과정 및 골-연골 경계부의 통합 능력을 향상시키는 생물학적 보강제로 기능할 수 있는지 규명하고자 하였다.
본 연구에서는 PLGA 지지체에 연골세포와 골모세포를 공배양하였으며, 자가혈소판풍부혈장의 적용 유무에 따른 세포의 배양 결과와 치유 효능을 비교 분석하였다. 공배양에 대한 생체 외(in vitro) 평가를 위해 세포 부착 및 증식률을 측정하였고, reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)을 통해 표현형 유지 여부를, 주사전자현미경 및 형광현미경을 통해 미세구조적 분포를 확인하였다. 또한 제작된 공배양 지지체의 치유 효능을 평가하기 위해 생체 내(in vivo) 평가를 시행하였다. 골-공배양 지지체-연골로 구성된 간극 모사 구조체(gap-mimic construct)를 제작하여 BALB/c-nude 마우스 피하에 이식하였다. 이식 4주 및 8주 시점에서 시편을 획득하여 거시적 결합, 조직학적 세포 침윤 여부 및 정량적 부착률 분석을 시행하였다. 또한 공배양 과정 및 지지체의 치유 효능 평가 과정에서 자가혈소판풍부혈장을 적용한 군과 적용하지 않은 군을 비교하여 자가혈소판풍부혈장이 상기 과정에서 생물학적 보강제로 기능할 수 있는지 추가적으로 확인하였다.
연구 결과, 생체 외 분석에서 공배양된 골모세포와 연골세포는 PLGA 지지체 위에서 고유의 표현형을 유지한 채 생존 및 증식하였다. 자가혈소판풍부혈장은 연골세포의 증식을 115%, 골모세포의 증식을 20% 추가로 증가시켰다. 생체 내 분석에서 세포가 포함된 지지체는 무세포 대조군에 비하여 골-연골 경계부에서 유의하게 높은 부착률를 보였으며, 단순한 물리적 접촉을 넘어 조직 간의 교차(interdigitation) 및 세포 침윤(cellular invation)을 보여 능동적인 조직 통합이 이루어짐을 확인하였다. 특히 자가혈소판풍부혈장 처리 시 이식 8주 시점에서 가장 높은 부착률(82.3%)와 가장 높은 비율의 세포 침윤(5/6개체)이 관찰되었고, 이식 4주 조기 시점부터 세포 침윤이 확인되어 자가혈소판풍부혈장이 경계부의 치유과정을 가속화하는 효과를 보여주었다.
결론적으로 본 연구를 통해 공배양된 연골세포와 골모세포를 포함한 PLGA 지지체가 골–연골 경계부 통합을 촉진할 수 있음을 확인하였다. 세포가 포함된 지지체는 골-연골 경계부 부착률과 세포 침윤 빈도 모두에서 세포가 없는 지지체보다 우수한 결과를 보였으며, 자가혈소판풍부혈장의 병용은 이러한 효과를 강화시켰다. 자가혈소판풍부혈장은 초기 세포 부착과 증식을 향상시키고, 경계부에서의 조직학적 통합을 가속화하는 보조적 역할을 수행한 것으로 판단된다. 이러한 결과는 공배양 세포와 자가혈소판풍부혈장을 결합한 지지체 기반 접근이 골–연골 경계부 재생을 위한 유망한 생체공학적 전략이 될 수 있음을 시사한다.

목차 (Table of Contents)

• 서 론 01
• 방 법 04
• 결 과 16
• 고 찰 29
• 참고문헌 35
• Figure Legends 41
• Abstract 44