폐렴구균 항원을 발현하는 Salmonella vaccine의 평가기술 연구 = Studies of strategies to evalute Salmonella vaccine expressing pneumococcal pneumoniae surface antigen

국문 초록 (Abstract)

본 연구의 목적은 Salmonella Agf fimbriae의 secretion system을 변형하여 Samlonella vaccine의 새로운 항원분비 체계를 개발하는 것이다. 특히, 이 분비 체계를 사용하여 폐렴구균 항원인 PspA의 발현 검증을 통해 vaccine의 면역반응 유도능을 조사하고자 한다. 우선 copy number가 높은 plasmid를 이용하여, E. coli에서의 발현을 확인하기위해 agfBAC gene을 pBluescript SK⁺에 cloning 시키고, 외부 항원의 fusion을 위해 agfA gene 내에 insertion site인 BamH Ⅰ, EcoR Ⅰ을 도입하였다. 다시 agfA gene내에 780bp의 pspA gene을 cloning 시킨 후, SDS-PAGE를 통해 50kDa 정도의 recombinant PspA protein을 확인하였다. 그런 다음, Salmonella vaccine strain에서 외부 항원이 fusion된 plasmid의 안정성을 증대시키고 균주의 생육을 확보하기위해 copy number가 낮고 asd gene을 selection marker로 가지고 있는 pYA3074를 이용하여 agfBAC-pspA gene을 cloning 시키고 SDS-PAGE를 통해 fusion protein의 발현을 확인하였다. 현재 공시 Salmonella vaccine균주를 동물 vaccine strain으로 사용하기 위해 host 동물에 적합하게 유도하는 실험을 진행 중이다. 즉 S. typhimurium 에 deletion과 allelic exchange 법으로 Δasd, ΔagfD812, ΔagfBAC 를 도입하고 attenuation을 위해 Δcrp mutant를 구축하는 과정에 있다.○ 연구목표
◇ 기존의 세균백신은 주로 사균 백신 혹은 subunit vaccine 이었으나 이들 백신은 제조 공정이 까다롭고 불안정한 단점이 있음.
◇ 주로 영.유아를 대상으로 하는 백신은 여러 번 반복 주사해야하므로 아나팔릭시스를 포함한 부작용과 투여의 어려움이 있음.
◇ 이러한 단점의 극복을 위해 다가 유전자 재조합 다가 백신이 활발하게 연구 중이며 이들이 상용화 될 경우 안전평가기술이 시급히 요구됨.
◇ 이러한 관점에서 Salmonella 생균 백신을 이용하여 외부항원 분비를 위한 새로운 항원발현 system을 개발하고 페렴 균의 항원 유전자를 carrying시켜 폐렴 항원의 효율적인 발현을 유도한과 동시에 Salmonella에 대한 면역성을 동시에 획득하는 vaccine개발을 주목적으로 연구를 디자인하였다.
○ 연구내용
◇ Agf fimbriae를 근간으로 한 발현항원의 분비체계 구축 : AgfA fimbriae의 major subunit인 AgfA을 cloning한 plasmid에 발현하고자 하는 외부항원을 sandwich시켜 fusion protein을 만든 후 이를 세포 외로 효율적으로 분비시키는 발현 system를 구축하고자 하였다.
◇ Salmonella typhimurium △agfBAC mutant construction : Agf를 이용한 외부항원 분비체계를 구축 하기 위해 숙주로 사용할 Salmonella 균의 chromosome에 있는 agfBAC operon을 delete 시킨다.
◇ PspA 항원발현 Asd+ plasmid 제조 : Salmonella vaccine strain이 지니고있는 balanced-lethal host vector system을 활용하기 위해 target antigen인 PspA 항원을 발현 할 수 있는 Asd+ recombinant plasmid (sandwich 항원발현용)를 제조 할 것임.
◇ PspA의 overpression 및 subcellular localization 확인.
○ 연구성과(응용분야 및 활용범위포함)
감염성 질병을 예방하기 위한 생 백신의 개발은 제조의 간편성 (여러 분자 생물학적인 기법의 발달로 유전자 조작이 용이함), 면역 방법의 수월성 (음료에 섞어 마시게 하므로 동시에 다수의 개체에 면역 가능), 탁월한 감염 예방 능력 (1회의 oral 면역으로도 감염을 예방함)등의 활용 가치를 지니고 있다. 따라서 이는 연구 진척 상황에 따라 무한의 잠재적 가치를 지니고 있다고 보여 진다. 유전자 재조합 다가 백신의 물리 화학 및 생물학적 특성들을 분석하고 향후 구체적인 평가 시스템을 갖추어 백신의 안전성 검증에 활용할 예정이다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The purpose of this study is that development of novel antigen secretion system for Salmonella vaccine by changed secretion system of Salmonella Agf fimbriae. Especially, we intended to exam the immune response ability of the vaccine by investigation wether PspA antigen was expressed. First, we confirmed that recombinant PspA was expressed in E. coli with high copy number plasmid. The agfBAC gene was cloned on pBluescript SK⁺ and then insertion site, BamH Ⅰ and EcoR Ⅰ, was introduced to create the fusion protein of foreign antigen and agfA. After the pspA gene of 780bp was cloned on agfA gene, recombinant PspA protein was detected with approximately 50kDa size by SDS-PAGE. Next, in Salmonella vaccine strain, pYA3074 which is low copy number plasmid and has asd gene as selection marker was used to allowance the stability recombinant plasmid. agfBAC-pspA genes were cloned on pYA3074 and then recombinant PspA protein was detected with approximately 50kDa size by SDS-PAGE. Now, the study which is to create the suitability strain for Salmonella vaccine is progressing. The S. typhimurium vaccine strain was constructed by introduction of deletion mutants Δcrp and Δasd. The strains, Δasd, ΔagfD812 and ΔagfBAC were constructed, Δcrp mutant for attenuation is going to construct.