Inhibitory effect of itraconazole on laser-induced choroidal neovascularization in rats

국문 초록 (Abstract)

나이관련 황반변성은 선진국의 노인 인구에서 실명을 유발하는 주요 질환이며, 맥락막신생혈관(choroidal neovascularization, CNV)은 나이관련 황반변성 환자에서 심한 시력 저하를 일으키는 가장 흔한 원인이다. 레이저광응고술, 광역학요법, 그리고 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF) 억제 약물의 유리체내 주사와 같은 기존의 치료법은 시력의 향상에 있어 그 효과가 제한적이다. 대부분의 환자들은 재발로 인한 반복적인 치료를 받게 되는데, 다수의 유리체내 주사는 심각한 합병증을 유발할 수 있으며, 치료 비용도 많은 부담이 된다.
이트라코나졸은 상대적으로 안전한 항진균제이며, 항혈관신생 효과를 가지고 있다. 최근의 연구에 의하면, 이트라코나졸은 설치류 실험과 인간의 내피세포를 이용한 in vitro 실험에서 종양 연관 혈관신생을 강하고, 선택적으로 억제하는 것으로 나타나, 임상적으로 병적인 신생혈관을 치료하는 데 효과가 있을 것으로 생각된다. 이에 본 연구에서는 쥐에서 레이저로 유도된 CNV에 대한 이트라코나졸의 항혈관신생 효과에 대해 알아보고자 하였다.
CNV를 유도하기 위해 수컷 Brown Norway rat의 양안 시신경 주위에 6개의 레이저 응고반을 만든 뒤 우안에는 1 μg/10 μl의 이트라코나졸, 좌안에는 동일한 양의 balanced salt solution (BSS)을 유리체내로 주입하였다. 레이저유도 14일 후, 비정상적인 혈관 누출을 조사하기 위해 형광안저혈관조영술을 시행하였고, CNV의 크기를 비교하기 위해 망막색소상피-맥락막 조직을 Alexa Fluor 488-conjugated isolectin B4를 이용하여 염색한 후 형광현미경으로 관찰하였다. RT-PCR과 Western blot을 통해 VEGF 수용체 2의 mRNA와 단백질, Akt와 ERK의 인산화에 대해 분석하였고, 망막 내의 VEGF 농도 측정을 위해 ELISA를 시행하였다.
유리체내 이트라코나졸은 BSS 투여군에 비해 CNV의 혈관누출과 크기를 유의하게 감소시켰다 (P = 0.002 for CNV 누출, P < 0.001 for CNV 크기). 또한, RT-PCR에서 이트라코나졸을 투여한 눈의 VEGF 수용체 2의 mRNA 발현이 BSS를 투여한 눈보다 유의하게 낮게 나타났고 (P < 0.001), Western blot에서는 레이저유도 14일 후 이트라코나졸을 투여한 눈에서 VEGF 수용체 2의 감소가 두드러졌다. ELISA를 이용하여 측정한 VEGF의 농도를 보면 이트라코나졸 투여군에서 801.7 ± 187.5 pg/mg으로 BSS 투여군의 988.0 ± 232.8 pg/mg 보다 유의하게 낮게 나타났다 (P = 0.043). 하지만, 레이저유도 14일 후 측정한 Akt와 ERK의 인산화는 두 군간에 유의한 차이를 보이지 않았다 (P = 0.258 for p-Akt, P = 0.730 for p-ERK).
본 연구에서 유리체내 이트라코나졸은 쥐에서 레이저로 유도된 CNV의 생성을 유의하게 억제하였으며, 이러한 항혈관신생 효과는 VEGF 수용체 2의 감소와 VEGF의 활성 억제를 통해 이루어지는 것으로 보인다. 즉, 이트라코나졸은 CNV의 치료에 적절한 대안이 될 수 있으며, 다른 치료와 병행하여 부가적인 치료법으로서도 활용 가능할 것으로 기대된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Age-related macular degeneration (AMD) is the leading cause of blindness in older people in developed countries. Severe vision loss in patients with AMD is commonly due to choroidal neovascularization (CNV). Current CNV treatments, such as laser photocoagulation, photodynamic therapy, and intravitreal injection of anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) drugs, have limited efficacy in improving vision. Patients often require repeated treatment because of recurrence. Multiple intraocular injections are associated with serious complications and high treatment costs.
Itraconazole, a relatively safe antifungal drug, has anti-angiogenic effects. In recent studies, itraconazole showed potent and selective inhibition of tumor-associated angiogenesis in murine models and in vitro assays using human endothelial cells. Itraconazole dose-dependently inhibited angiogenesis, suggesting it may be useful in treating pathological angiogenesis. The aim of this study was to evaluate the anti-angiogenic effect of itraconazole on laser-induced CNV in rats.
Six laser burns were induced in the peripapillary area of each eye of male, adult Brown Norway rats (200-250 g) to cause CNV. Right eyes were administered intravitreal injections of 1 μg/10 μl itraconazole; left eyes received 10 μl balanced salt solution (BSS) as controls. On day 14 after laser induction, fluorescein angiography (FA) was used to assess abnormal vascular leakage. Flattened retinal pigment epithelium (RPE)-choroid tissue complex was stained with Alexa Fluor 488-conjugated isolectin B4 to measure the CNV areas with an image analysis program. VEGF receptor 2 (VEGFR2) mRNA and protein expression and phosphorylation of Akt and ERK were determined by quantitative RT-PCR or Western blot. The VEGF concentration in the retina was analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
Intravitreal itraconazole significantly reduced leakage from CNV as assessed by FA and CNV area on flat mounts of the RPE-choroid complex when compared with intravitreal BSS on day 14 after laser induction (P = 0.002 for CNV leakage, P < 0.001 for CNV area). Quantitative RT-PCR showed significantly lower expression of VEGFR2 mRNA in RPE-choroid complexes from itraconazole-injected eyes than from BSS-injected eyes (P < 0.001). Western blots indicated that VEGFR2 was downregulated after 14 days of itraconazole treatment. ELISA assay showed a significant difference in VEGF concentration between itraconazole- and BSS-injected eyes (801.7 ± 187.5 vs. 988.0 ± 232.8 pg/mg total protein; P = 0.043). However, phosphorylation of Akt and ERK showed no significant differences between groups at day 14 after laser induction (P = 0.258 for p-Akt, P = 0.730 for p-ERK).
In conclusion, this study demonstrated that intravitreal itraconazole significantly inhibited the development of laser-induced CNV in rats. Itraconazole had anti-angiogenic activity by reducing VEGFR2 expression and inhibiting VEGF activity. Itraconazole may prove beneficial for treating CNV as an alternative or adjunct to other therapies.