사람 선줄기세포를 이용한 생물공학적 제어기술 기반의 타액선 재생 치료기술 개발(2016) = Development of Cell Therapeuticics Based on Bioproengineering Process of Human Glandular Stem Cells

국문 초록 (Abstract)

연구의 목적 및 내용 : 본 연구팀은 타액선 조직 내 선줄기세포를 이용하여 생물공학기술 (3차원 스페로 이드 배양기법, 나노섬유 세포지지체, 세포 프라이밍 등)을 통한 기능성 세포치 료제 및 소재융합기술을 통한 세포-지지체 이식 치료제를 개발하고자 함. 연구개 발한 후보치료제의 in vivo, in vitro 유효성 및 개념 증명, 종양원성 안전성 구축을 통해 임상적용의 타당성을 확립하여 난치성 구강건조증의 새로운 치료전략 을 수립하고자 함.
연구개발성과
가. 연구개발 내용
(1) 난치성 구강건조증 치료를 위한 고순도, 기능강화 선줄기세포 이식치료 기술 확립
◾ 고순도 인간 선줄기세포 분리 및 줄기세포 특성 분석 (Yi T et al. Sci Rep 2016 Published, 국내특허 출원 완료)
· 인간 선줄기세포 분리 및 배양: 층분리 배양법을 이용하여 분리한 고순도 선줄기세포를 분리 배양함.
· 선줄기세포의 선정 및 확보: 분리 및 배양한 고순도의 선줄기세포에서 줄기세포 고유의 마커가 증가됨을 확인.
· 선줄기세포의 오믹스 분석을 통해 마커 발굴과 검증: Microarray분석을 통해 선줄기세포에서 많이 발현되는 줄기세포의 고유 마커 뿐만 아니라 선줄기세포에서 특이적으로 발현되는 마커 확인.
· 선줄기세포의 타액선 조직 재생 및 기능 보호 작용기전 In vivo 규명
◾ 생체모방형 마이크로패턴 지지체를 이용한 스페로이드 배양기술 타당성 검증 (Shin HS et al. Acta Biomater 2016 Published / 국내특허 출원 완료)
· 타액선전구세포와 생체재료(마이크로웰)를 이용한 3차원 배양기술 타당성 검증
· 타액선전구세포와 생체재료를 이용한 3차원 배양 후 면역염색으로 타액선 마커 발현 증대 확인
· 타액선전구세포와 생체재료를 이용한 3차원 배양 후 타액선세포의 기능 향상 검증
◾ 세포공학적 기법에 의한 사람 선줄기세포의 기능 강화 검증 (Stem Cells, submitted / 국내특허 출원 완료)
· 마이크로웰을 이용한 3차원 스페로이드 배양을 통한 줄기세포 기능 향상 기술 확립
· 3차원 스페로이드 배양을 통한 줄기세포 기능 향상을 줄기세포 마커 발현. 타액선세포로의 분화능 증대를 통해 확인함
· 3차원 스페로이드 배양을 통한 기능이 강화된 줄기세포의 분화시 타액선 기능의 향상을 검증함
· Microarray 분석을 통해 타액선세포 기능증대에 Wnt signaling이 관여함을 확인함
· 사람 선줄기세포의 생체 내 이식 프로토콜을 확립함
· in vivo 이식을 통해 3차원 스페로이드 배양을 통해 기능이 증대된 줄기세포의 조직 재생능이 증가함을 검증함.
(2) 사람 선 줄기세포의 종양원성 검증 및 극복 전략 수립
◾ 사람 선 줄기세포의 노화(senescence) 현상 확인
· 계대배양 15 passage가 지나가면 in vitro상에서도 증식하지 못하고, 노화됨
· telomerase 활성도가 감소됨을 보여, 불멸화되는 과정이 존재하지 않음을 확인함
◾ 사람 선 줄기사람 선 줄기세포의 종양 증식성 분석
· 사람 선암 세포주에 비해 in vitro에서 월등히 증식능력이 감소하였으며, 종양의 중요 특성중 하나인 anchorage-independent growth 현상도 관찰되지 않았으며, in vivo에서도 마우스에 종양을 형성하지 못했다. 따라서 사람 선줄기세포는 종양학적으로 안전하다는 것을 확인하였음
◾ 사람 선 줄기세포의 종양 유전자 발현 분석
· 사람 선 줄기세포는 거의 모든 발암 유전자의 발현이 사람 선암 세포에 비해 크게 낮아 있음이 관찰
◾ 마이크로웰에서 배양된 사람 선 줄기세포의 종양성 조사
· 사람 선 줄기세포를 microwell에서 배양한 후 노화 및 in vitro tumorigenecity를 조사한결과, 특별히 종양성의 증가됨이 관찰되지 않아, 사람 선 줄기세포는 microwell 배양에서도 안전성이 있음을 확인 (submitted)
(3) 사람 선줄기세포 배양을 위한 멀티스케일 다기능성 스케폴드 개발
◾ 생체적합성 고분자를 이용한 생체모방형 멀티스케일 지지체 제조
· 하이드로젤 패턴닝을 도입하여 나노/마이크로의 멀티스케일 스케폴드 제조
· 제조된 스케폴드에 펩타이드를 결합시켜 센서로의 응용도 증명함 (Anal. Chem. 2016 published)
◾ 나노섬유 마이크로패턴 스케폴드를 이용한 사람 선줄기세포 스페로이드 배양기술 개발 (국내특허 출원 완료)
· 동일한 나노섬유 시트 위에 서로 다른 크기의 마이크로 단위로 well 패턴닝을 함.
· 200um 크기의 well 패턴에서 위 단백질들의 발현도가 가장 높게 나타남.
◾ 최적의 조건에서 배양된 스페로이드 회수 기술 개발
· PCL 나노섬유에 pNIPAAm을 결합하여 온도감응성의 특징을 이용하여 스페로이드 회수를 증대시킴: 전체적인 스페로이드 회수율은 약 21%임.
· PCL과 pNIPAAm이 blending된 용액으로 전기방사 진행하여 PCL/pNIPAAm blended 나노섬유 스케폴드 제작: 탈착 효율 약 65%로 향상됨을 확인
◾ 생체주입형 하이드로젤 개발
· Alginate를 이용하여 생체주입형 하이드로젤 제작
· 생체주입형 하이드로젤의 생체적합성 확인: alginate에 세포를 섞어주어 bead 형태로 경화시켜 하이드로젤 제작 후 세포 증식이 활발히 일어남으로 보아 세포 배양에 적합함을 확인
◾ 정성적 연구 개발 성과
· 기능강화, 고순도의 사람 유래 선줄기세포은행을 구축
· 선줄기세포로 제조되는 스페로이드 생산 증대 기술 확립
· 난치성 방사선 손상 질환 치료용 약물 개발을 위한 플랫폼 기술 확립
연구개발성과의 활용계획(기대효과)
· 난치성 질환인 구강건조증 예방 및 치료를 위한 사람 선줄기세포의 임상적용 근거 마련
· 새로운 선줄기세포 확보 기술 및 기능강화 기술 확립을 통한 다양한 선 조직재생분야 학문 발전기여
· 방사선치료에 의한 다양한 조직 손상의 예방 /치료 기술개발 및 검증에 활용
· 신약후보물질 타깃 발굴 및 다양한 지적재산권 (특허, 기술이전)의 도출과 이를 통한 신의료 산업 선도
· 사람 선줄기세포 이외의 다른 중간엽 줄기세포의 안정성 검증에도 활용
· 3차원 스케폴드 시장과 줄기세포 시장의 융합 및 생명과학분야 발전에 기여

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Purpose : To develop cell therapeutics based on human salivary glandular stem cells (hSGSCs) with or without delivery matrices which are modulated by the bioprocessing process including 3D spheroid culture on our new nanofibrous scaffolds. To establish a new therapeutic strategy for treat xerostomia by validation of our new therapeutics through proof of concepts, in vivo efficacy and safety.
Results
◾ Establishment of therapeutic approaches based on highly purified, functionally enhanced hSGSCs
1-1) In vitro validation of 3D spheroid culture of hSGSCs
1-2) In vivo validation of 3D spheroid culture of hSGSCs
1-3) In vitro evidence of therapeutic function of modulated hSGSCs
1-4) In vivo proof of hSGSCs-hydrogel fusion technology
1-5) Development of a method to deliver hSGSCs modulated by 3D spheroid culture
1-6) Banking of hSGSCs through validation of characteristics as stem cell therapeutics
◾ Verification of oncogenic possibility of hSGSC
2-1) Verification of oncogenic possibility of 2D culture of hSGSCs
2-2) Verification of oncogenic possibility of 3D culture of hSGSCs
2-3) Verification of oncogenic possibility of hSGSC in associated with normal epithelial cell
2-4) Verification of oncogenic possibility of hSGSC in associated with cancer stem cell
2-5) Identification and verification of candidate gene developing oncogenic possibility of hSGSC
◾ Development of multi-scale and multi-functional scaffold for the culture of human glandular stem cells
3-1) Development of micropatterned nanofiber scaffold by combining electrospinning and hydrogel patterning
3-2) Optimization of culture condition for the formation of hSGSC spheroid using micropatterned nanofiber scaffold
3-4) Recollection of hSGSC spheroids using stimuli-responsive materials
3-4) Developemnt hydrogel system for the implantation of hSGSC spheroids
3-5) Establishment of stem cell-scaffold evaluation and standardization of fabrication methods
· Guidance of new medical industry through the establishment of various intellectual property (paper, patent, technical transfer)
◾ Qualitative development results
· Establishment of flatform technology of bioprocessing by modulation based on 3D spherod culture for treatment radiation-induced SG hypofunciton
· Banking of highly purified, safe, and efficient hSGSCs
· Development of scaffolds to modulate stem cell functions
Expected Contribution
· Inflection on prevention or treatment of radion therapy-induced tissue damage
· Development of originality of core technology for regulation of grandular stem cell function
· Development of new drug by connecting with korea biocompany focusing on development of stem cell therapeutics
· Contribution on establishment and extension of technology for new drug development which can be used in various gland tissues
· Training of expert in the field of GSC function and grandular tissue homeostasis