몇가지 글루타치온 고갈제에 의한 생쥐 대뇌 피질세포의 손상 기전에 대한 연구 = (A) Study on the mechanism of oxidative injury induced by some glutathione depletors in mouse cortical cell culture

국문 초록 (Abstract)

산화적 세포손상(oxidative cellular injury)은 뇌졸중, 외상성 뇌손상및 간질 뿐만 아니라 만성 퇴행성 신경계 질환의 주된 신경병리학적 기전 중의 하나이다. 대표적 세포내 항산화 물질인 글루타치온이 산화적 세포손상시 고갈되며 이 글루타치온의 고갈이 세포손상과 관계가 있음이 알려져 있다. 본 연구에서는 글루타치온 생성 억제제인 buthionine sulfoximine (BSO), 글루타치온 제거제(chelator)인 diethyl maleate (DEM)와 phorone을 산화적 손상 유발 약제로 사용하였고, 이들 약물에 의한 세포사에 trolox (항산화제, vitamin E analog), cycloheximide (CHX; 단백 합성 억제제), pyrrolidine dithiocarbamate(PDTC; 항산화제, NF-_kB활성 억제제) 및 MK-801 (NMDA 수용체 길항제)의 영향을 조사하여 글루타치온 고갈에 의한 산화적 신경세포 손상의 기전을 이해하고자 하였다.
태령 14-17일 된 생쥐 대뇌 피질 신경세포를 미리 교세포가 배양된 배양접시에 13-15일 배양하여 사용하였으며 세포사는 약물을 처리하고 나서 일정시간이 지난 후 배양접시의 배지내로 유출된 lactate dehydrogenase (LDH)의 양을 측정하여 정량하였다.
BSO (1mM), DEM (200μM) 및 phorone (1mM) 처리는 글루타치온 농도를 감소시켰다. DEM 처리 30분, 4시간 후 대조 글루타치온 양의 30 및 15% 수준으로 감소하였으며 이 감소는 24시간 후까지도 비슷한 수준으로 유지되었다. BSO 처리로는 30분 후 대조 글루타치온 양의 50% 수준으로 감소한 후 시간이 경과함에 따라 점차 더 감소하여 24시간 후에는 대조 글루타치온 양의 15%로 감소하였다. Phorone 처리는 30분 후 대조 글루타치온 양의 60% 수준으로 감소하였고 4시간 후 약 40%로 감소하였으나 시간 경과에 따라 더 이상 감소하지 않았고 오히려 회복되었다. BSO 24시간 처리로는 경미한 신경독성(0-10%)을 나타냈으나 48시간 처리 후에는 현저한 신경독성을 나타냈다. BSO에 의한 신경독성은 trolox 또는 CHX 처리에 의해 현저히 억제되었으며 MK-801 처리에 의해서도 유의한 억제를 보였으나 PDTC에 의해서는 영향받지 않았다.
DEM은 24시간 처리로 약 25 - 50%의 신경세포사를 유발하였으며 48시간 처리로는 거의 모든 신경세포는 물론 교세포도 사멸시켰다. DEM에 의한 세포독성은 trolox에 의해서 현저히 억제되었고, PDTC에 의해서도 유의하게 억제되었으나 CHX 혹은 MK-801로는 영향받지 않았다. Phorone은 24시간 처리로 경미한 신경독성(0-15%)을 보였고 48시간 처리로는 약 40%의 신경세포사를 유발하였다. Phorone에 의한 신경독성은 CHX 처리로 현저히 억제되었으나 trolox, MK-801 혹은 PDTC에 의해서는 영향받지 않았다.
이상의 성적은 세포내 글루타치온 고갈에 의한 신경세포 손상은 글루타치온 고갈 속도와 고갈 정도에 의해 결정됨을 가리키고 있으며, BSO 의 신경독성에는 주로 세포 막지질 과산화와 단백합성이 관여하고, 흥분 독성도 일부 관여하며, DEM에 의한 세포손상은 활성산소의 생성에 의한 세포 막지질 과산화작용이 그 주요 기전이고, phorone의 신경독성은 세포 막지질의 과산화와는 관계가 없으며 세포손상을 유발하는 단백합성을 통해 세포사가 일어나고 있음을 가리킨다. 즉 세포내 글루타치온을 감소 시키는 약물에 의한 신경세포 손상작용에 서로 다른 기전이 관여할 수 있음을 시사하고 있다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Oxidative stress has been known as a major neuropathologic mechanism in chronic neurodegenerative disorders as well as in stroke, trauma and epilepsy. Glutathione (GSH) is major endogenous cellular antioxidant. Depletion of GSH has been shown to induce oxidative stress or to enhance the cytotoxicity of various oxidative insults.
To gain information on the mechanisms underlying the oxidative neuronal injury induced by GSH depletion, the cytotoxic effects of some GSH depletors were examined under the presence of trolox (TLX; water and lipid soluble vitamin E analog), cycloheximide (CHX; protein synthesis inhibitor), pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC; antioxidant) or MK-801 (NMDA receptor antagonist) in primary murine mixed cortical cell culture in 13 ∼15 days in vitro. The author used buthionine sulfoximine (BSO; GSH synthesis inhibitor), diethyl maleate (DEM; cytosolic GSH conjugator) and phorone (cytosolic and mitochondrial GSH conjugator) as the GSH depletors. Cell death was assessed by measuring LDH efflux to bathing media at the end of exposure.
DEM (200 μM) reduced the total cellular GSH content to 15% of the control value by 4 hr exposure and maintained the level to 24hr. BSO (1 mM) reduced the GSH content to 15% of the control value by 24 hr exposure. The GSH reduction rate of BSO was slower than that of DEM. Phorone (1 mM) reduced the GSH content to 40% by 4hr exposure but the content recovered to 60% by 24hr exposure.
BSO (30 μM-1mM) showed a minimal neurotoxicity (0-10%) at the end of 24 hours exposure, but marked neuronal cell death at the end of 48 hr exposure. The BSO (1 mM)-induced neurotoxicity by 48 hr exposure was markedly inhibited by co-treatment with TLX (100 μM) or CHX (1㎍/㎖) and partially attenuated by MK-801 (10 μM). PDTC (50 μM) did not affect the BSO-neurotoxicity.
DEM (0.1-1mM) induced concentration dependent cytotoxicity at the end of 24 hr exposure. Over the doses of 400 μM, it induced not only neurotoxicity but glial toxicity. DEM (200 μM)-induced neurotoxicity was markedly inhibited by TLX (100 μM) or PDTC (50 μM). Neither CHX nor MK-801 affected the DEM-neurotoxicity.
Phorone (1 mM) induced minimal neurotoxicity at the end of 24 hr exposure and showed moderate neurotoxicity (40%) at the end of 48 hr exposure. Only the cotreatment with CHX (1㎍/㎖) showed significant inhibitory effect on the phorone-induced neurotoxicity.
These results suggest that the three GSH depletors induce oxidative neuronal injury via different mechanisms such as membrane lipid peroxidation or death gene expression, depending on the rate and the extent of cellular GSH depletion.

목차 (Table of Contents)

• 국문초록 = 1
• 서론 = 3
• 실험방법 = 5
• 실험성적 = 8
• 고찰 = 17
• 요약 = 22
• 참고문헌 = 24
• 영문초록 = 29