TAP 분석을 이용한 BAF53연관 단백질의 분리

국문 초록 (Abstract)

chromosome territory와 replication foci가 정상적인 형태를 유지하기 위해서는 BAF53가 필요하다. 그리고 BAF53는 chromatin 구조를 조절하는 것으로 알려진 여러 종류의 chromatin remodeling complex의 구성단백질로 알려져 왔다. 위 결과들은 chromosome territory를 구성하는 chromosome subdomain과 같은 higher-order chromatin 구조를 구성하는 구성 성분에 BAF53가 포함되어 있을 가능성을 보여준다. 그리고 이전에 발견된 BAF53 complex에서는 higher-order chromatin 구조를 조절하는 기능을 밝혀지지 않고 있다. 이러한 결과는 BAF53가 이전에 발견된 BAF53 complex와는 다른 기능을 갖는 새로운 complex를 형성할 가능성을 제안한다. 본 논문에서는 TAP(Tandem Affinity Purification)을 붙인 BAF53을 제조하고 BAF53-TAP을 대상으로 tandem affinity purification을 수행하여 BAF53과 결합하는 단백질을 조사하였다. TAP-tagged BAF53으로는 BAF53(WT)-TAP과 ATPase-inactive mutant인 BAF53(S20A)-TAP, BAF53(G173D)-TAP, 그리고 BAF53(S20A/D171A)-TAP을 제조하여 사용하였다. BAF53의 ATPase 활성은 BAF53가 complex를 이루고난 후 complex로부터 분리 되어질 때 필요한 것으로 제안되었다. glycerol gradient sedimentation analysis를 수행하여 BAF53-TAP들이 250 kDa 이상의 큰 단백질 complex를 형성함을 확인하였다. BAF53(WT)-TAP과 BAF53(S20A)-TAP을 사용하여 tandem affinity purification을 수행하였으며, MALDI-TOF/TOF를 수행하여 얻어진 단백질을 동정하였다. T-complex protein, WASH complex subunit 7, ACINUS, CCDC74A, SLC25A5가 BAF53가 결합되어 있는 단백질 후보로 밝혀졌다.

목차 (Table of Contents)

• 제 1 장 서론 8
• 제 2 장 실험 방법 14
• 1) Retroviral packaging HEK 293t 세포 배양 14
• 2) Site-directed mutagenesis 14
• 3) Cloning 15
• 4) Glycerol gradient sedimentation분석을 위한 transfection 16
• 5) Glycerol gradient sedimentation 17
• 6) TAP 분석을 위한 transfection 18
• 7) TAP(tandem affinity purification) 18
• 8) Mass spectroscopy(MALDI-TOF/TOF) 20
• 제 3 장 결과 및 고찰 24
• 1) BAF53-TAP 및 ATPase-inactive BAF53-TAP 제조 24
• 2) p293t 세포에서 BAF53-TAP의 발현 25
• 3) p293t 세포에서 발현된 BAF53-TAP에 의한 complex 형성 25
• 4) TAP purification에 의한 BAF53-TAP complex 분리 26
• 5) p293t 세포에서 발현된 BAF53-TAP에 의한 complex 종류 확인 27
• 6) MALDI-TOF/TOF analysis에 의한 BAF53-associated protein의 분석 28
• 7) 고찰 36
• 제 4 장 참고문헌 40