Study on physicomechanical and biological properties of nanoparticulate CaCO3 modified calcium silicate cement = 나노 탄산칼슘(CaCO3) 첨가 칼슘 실리케이트 시멘트의 물리기계적 및 생물학적 특성에 관한 연구

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Calcium silicate cement (CSC) is widely used in endodontic treatments due to its excellent biocompatibility and favorable physical properties. However, its prolonged setting time remains a significant clinical limitation. Nanoparticulate calcium carbonate (NPCC) has been reported to accelerate the setting of mineral trioxide aggregate (MTA), suggesting potential as a cement accelerator. This study aimed to investigate the effects of NPCC on the biological properties of CSC, including their cytotoxicity, in vitro osteogenic activity, and interactions with rat femur tissue.
CSCs incorporating NPCC (CSC-NPCC) at concentrations ranging from 2.5% to 20% were prepared and mixed with deionized water at a 1:0.8 ratio. Physicomechanical properties including setting time, solubility, dimensional stability, and compressive strength were evaluated. In vitro experiments were conducted using mouse-derived bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs). The expression of osteogenic genes (RUNX2, OCN, ALP, COL-1) was analyzed via RT-PCR, and mineral deposition was assessed using Alizarin Red S staining. For in vivo analysis, CSC-NPCC was implanted into rat femurs, and histological evaluations were performed to assess biocompatibility and bone regeneration.
CSC-NPCC demonstrated improved physicomechanical properties, including reduced setting time, solubility, enhanced compressive strength, and maintained dimensional stability. At 75% eluent concentration, CSC and CSC-NPCC (2.5%) reduced BMSC viability, while higher NPCC concentrations (5%, 10%, 20%) did not affect cell viability. These higher NPCC concentrations also promoted osteogenic genes expression and enhanced extracellular matrix mineralization. In rat femurs, NPCC facilitated the resorption of CSC and promoted bone regeneration at the implant site. The CSC alone group occupied 22.2±3.25% of the total femoral area at the implantation site, whereas the CSC-NPCC (20%) group occupied only 4%. Notably, higher NPCC concentrations were associated with proportionally increased new bone formation. These findings suggest that CSC-NPCC has potential as a biodegradable bone cement for use in bone defect areas that require regeneration.

Keywords: Nanoparticulate calcium carbonate, calcium silicate cement, bone marrow mesenchymal stem cells, osteogenesis, bone regeneration

국문 초록 (Abstract)

규산칼슘 시멘트 (calcium silicate cement, CSC)는 우수한 생체적합성과 물리적 특성으로 인해 다양한 근관치료에서 널리 사용되고 있다. 그러나 긴 경화 시간은 임상 적용 시 주요한 제약 요소로 작용한다. 나노입자형 탄산칼슘 (nanoparticulate calcium carbonate, NPCC)은 mineral Trioxide Aggregate (MTA)의 경화 시간을 단축시키는 것으로 보고되어, 시멘트 촉진제로서의 가능성이 제시된 바 있다. 본 연구는 NPCC가CSC의 생물학적 특성, 즉 세포독성, 골형성 특성, 그리고 생체 내 골 조직과의 상호작용에 미치는 영향을 평가하고자 하였다.
NPCC를 포함한 CSC (CSC-NPCC)를 제조하기 위하여 2.5%부터 20%까지의 농도의 NPCC를 포함한 CSC와 탈이온수를 1:0.8의 비율로 혼합하였다. 이후 경화 시간, 용해도, 치수 안정성, 압축 강도 등의 물리적 및 기계적 특성을 평가하였다. 시험관 내 실험에서는 RT-PCR을 이용하여 RUNX2, OCN, ALP, COL-1 등의 골형성 관련 유전자의 발현을 분석하였고, Alizarin Red S 염색을 통해 무기질화를 관찰하였다. 또한, 생체 내 생체적합성 평가를 위해 CSC-NPCC를 랫드 대퇴골에 이식하고 조직학적 분석을 수행하였습니다.
CSC-NPCC는 경화 시간의 단축, 용해도의 감소, 압축 강도의 향상, 치수 안정성의 유지 등 개선된 물리적·기계적 특성을 나타내었다. CSC 단독 및 2.5% NPCC가 포함된 CSC (CSC-NPCC 2.5%)의 용출액에 24시간 동안 노출된 마우스 유래 골수 중간엽 줄기세포(Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells, BMSCs)는 75% 용출액 농도에서 세포 생존율이 감소하는 것으로 나타났다. 반면, CSC-NPCC (5%, 10%, 20%)는 세포 생존율에 유의한 영향을 미치지 않았다. CSC-NPCC (5%, 10%, 20%)는 골형성 유전자의 발현을 증가시켰으며, 미네랄의 세포외 기질 축적을 촉진하였다. 랫드 대퇴골 이식 결과, NPCC는 CSC의 흡수를 촉진하고 이식 부위의 골 재생을 강화하였다. CSC 단독군은 이식 부위 대퇴골 면적의 22.2±3.25%를 차지한 반면, CSC-NPCC(20%)는 4%로 대부분 흡수된 양상이 나타났다. 전체적으로NPCC 농도가 높을수록 새로운 골 형성이 비례적으로 증가하는 경향을 보였다. 이러한 조직학적 결과는 NPCC가 함유된 CSC가 재생이 필요한 골 결손 부위에 적용 가능한 생분해성 골 시멘트로서의 잠재력을 가짐을 시사한다.
주요어 :나노입자 탄산칼슘, 규산칼슘 시멘트, 골수 중간엽 줄기세포, 골형성, 골 재생

목차 (Table of Contents)

• Abstract i
• Table of Contents iv
• Chapter 1. Introduction 1
• 1.1. Calcium silicate cement (CSC)
• 1.2. Calcium carbonate nanoparticles used in cement-based materials
• 1.3. The biological properties of NPCC
• 1.4. Purpose of research
• Chapter 2. Materials and Methods 10
• 2.1. Preparation of CSC and characterization of CSC and NPCC
• 2.1.1. Synthesis of CSC powder and NPCC incorporation
• 2.1.2. Morphological and crystalline phase characterization
• 2.2. Analysis of physicomechanical properties of CSC-NPCC
• 2.2.1. Setting time
• 2.2.2. Solubility
• 2.2.3. Compressive strength
• 2.2.4. Dimensional change
• 2.3. Analysis of biological properties of CSC-NPCC
• 2.3.1. Isolation of mouse BMSCs
• 2.3.2. Preparation of CSC-NPCC eluents
• 2.3.3. Cytotoxicity assessment
• 2.3.4. Osteogenic activity assay
• 2.3.5. Extracellular matrix mineralization
• 2.3.6. Implantation of CSC-NPCC into rat femurs
• 2.3.7. Statistical analysis
• Chapter 3. Results 25
• 3.1. SEM morphology and chemical composition of CSC and NPCC
• 3.2. Effects of NPCC on physicomechanical properties of CSC
• 3.3. Cytotoxicity and osteogenic activity of CSC-NPCC
• 3.4. Tissue responses to CSC-NPCC in rat femur
• Chapter 4. Discussion 34
• Chapter 5. Conclusion 40
• Reference 41
• Abstract in Korean 52