Adipic acid의 添加와 耐性菌株 starter 이용에 따른 김치의 保存性 向上 = Improvement of Kimchi preservability by adding adipic acid as additive and acid tolerance mutant as starter

국문 초록 (Abstract)

김치발효에 관여하는 균종들에 대해 항균작용이 있는 것으로 알려진 adipic acid를 김치제조시 첨가하고, 동시에 내산성균주의 starter를 넣어 발효시키므로써 김치의 저장기간 연장과 풍미를 증진시키고자 하였다. 즉 김치발효의 주요 숙성균주로서 산에 약한 Leu. mesenteroides를 adipic acid에 대해 내성을 갖도록 변이시켜, 그 한 주로 starter를 조제하여 adipic acid와 함께 김치에 starter로 첨가하여 김치의 저장성과 풍미의 변화를 조사하였다 또한 starter로 사용한 adipic acld 내성균주의 특성을 조사하였다.
1. 김치 발효의 주요 젖산균종인 Lac. plantarum, Leu. mesenteroides, Leu. paramesenteroides, str. faecalis, 및 Ped. cerevisiae에 대한 adipic acid의 저해능을 조사하기 위하여 MRS 배지에 adipic acid를 0 ~ 0.2% 첨가한 후 5 ~ 20℃에서 배양하면서 조사한 결과 김치 젖산균 모두에 대해 생육억제능이 있었으며, 첨가농도가 높을수록 높은 증식저해 효과를 확인할 수 있었고, 이러한 저해능은 온도가 낮을수록 증가되는 것으로 확인되었다. 따라서 김치제조시에 adipic acid 처리후 낮은 온도를 유지하면 상승 효과가 있을 것으로 기대된다.
2. 김치에 adipic acid를 0, 0.1, 0.12, 0.14, 0.16, 0.18 및 0.20%의 농도로 첨가하여 10℃에서 발효시키면서 pH와 총산도의 변화 및 관능특성을 조사한 결과 adipic acid 첨가구 모두 pH와 총산도가 대조구에 비해 적은 변화를 나타내어 산패지연 효과가 확인되었으며, 발효 21일째의 경우 adipic acid 0.16% 첨가구는 pH가 4.69, 총산은 0.81%로서 대조구의 pH 3.89, 총산 1.10%보다 첨가구가 산의 생성이 적었다. 또한 관능특성에서 adipic acid의 첨가량이 0.16%까지는 대조구에 비해 종합적인 기호도가 우수하였으나, 0.18% 이상에서는 오히려 저하되었다. 따라서 김치제조시 adipic acid의 적절한 첨가농도는 0.16% 수준이라고 생각된다.
3. 김치에서 분리한 Leu. mesenteroides와 Leu. paramesenteroides 두 균주를 adipic acid에 대한 내성과 내염성을 갖도록 변이시키고, adipic acid 0.16%와 함께 두 변이주를 각각 단독으로 또는 두 변이균주의 혼합 균주(1:10)로서 김치제조시 starter로 첨가한 경우, 산패지연 효과와 관능특성 면에서 변이주의 단독첨가 보다 혼합균주인 경우와 0.005% 첨가구가 가장 우수하였다.
4. Adipic acid에 대해 내성을 갖도록 변이된 Leu. mesenteroides(ANaM100)와 Leu. paramesenteroides(ANaP100) 변이균주의 내산성 특성을 야생균주와 비교한 결과 수소이온 투과도의 경우 pH 5에서 t_(1/2) 값이 Leu. mesenteroides의 야생균주는 5.4분, 변이균주는 8.4분이었고 Leu. paramesenteroides의 야생균주는 4.3분, 변이균주는 4.8분으로서 변이균주가 내산성이 높았다.
H^(+)- ATPase 활성은 maximal activity가 Leu. mesenteroides의 야생균주는 pH 6.0에서 0.87 unit/mg protein, 변이균주는 pH 5.5에서 0.92unit/mg protein 이고, Leu. paramesenteroides는 모두 pH 6.0에서 야생균주는 0.59 unit/mg protein, 변이균주는 0.63 unit/mg protein으로서 두 균주 모두 변이균주가 야생균주보다 활성이 높았다.
Glycolysis의 pH 의존성의 경우 두 균주 모두 최적 pH가 야생균주보다 변이균주가 낮지는 않았으나, 측정 pH 범위내에서 변이균주가 증대된 대사활성 을 보였다.
세포막의 산 손상(acid damage)에 의한 Mg^(++) 해리도에서도 pH 4.0에서 2시간 경과후 Leu. mesenteroides 야생균주는 27.6%, 변이균주는 12.8%, Leu. paramesenteroides 야생균주는 52.2%, 변이균주는 27.3% 로서 야생균주에 비해 약 1/2가량 Mg^(++)이 적게 유출되어 산에 의한 세포막 의 손상이 적었다.
원형질막의 지방산 조성은 두 변이균주가 C_(18:1) 감소하고, C_(19:1), cyclo는 증가하여 내산성이 증대되었다.
따라서 이들 변이균주들은 각각의 야생균주에 비해 내산성이 증가되었음이 확인되었다.
결론적으로 김치발효에 관여하는 젖산균들에 대해 생육억제능을 갖고 있는 adiplc acid를 김치제조시 첨가하고, 이상젖산발효균으로서 풍미가 우수한 Leu. mesenteroides와 Leu. paramesenteroides를 adipic acid에 대해 내성을 갖도록 변이시켜 이들 혼합균주(1:10)를 starer로 0.005% 첨가하여 10℃에서 발효시키면서 pH, 총산도 및 관능특성을 조사한 결과 산패지연 효과와 함께 우수한 관능특성을 보였다. 또한 대조구에 비해 가식기간이 2.5배 이상 연장되었다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

To improve preservability and flavor of kimchi by adding adipic acid, an antibacterial agent, Leuconostoc mesenteroides and Leu. pararnesenteroides were mutated to increase their tolerance to adipic acid. And then, the mutated strains were used as a starter culture for the fermentation of kimchi with a various concentrations of adipic acid.
The results are as follows.
1. The inhibition activity of adipic acid to the strains of Lactobacilluse plantarum, Leuconostoc rnesenteroides, Leu. paramesenteroides, Streptococcus faecalis and Pediococcus cerevisiae was investigated.
The activity of adipic acid to inhibit the growth of lactic acid bacteria in kimchi was increased with increasing concentrations of adipic acid up to 0.2% at 5℃.
2. The kimchi treated with a various concentrations of adipic acid from 0 to 0.2% at 10'E delayed acid fermentation compared to a control one, based on the results of the change of pH value and total acidity. The result of organoleptic test showed that the taste of kimchi was more acceptable at a concentration of 0.16% adipic acid than the others.
3. The inoculum volume was determined as 0.005% of the two mixed mutant strains with a ratio of 1:10, Leu. mesenteroides : Leu. paramesenteroides based on the results of acidification and organoleptic test.
4. The acid tolerance of the mutants was increased based on the results of determining acid tolerance factor such as proton permeability of cytoplasm, activities of H^(+)-ATPase, pH-dependence of glycolysls, Mg^(++) release and fatty acid composition of cytoplasmic membranes for Leu. mesenteroides and Leu. paramesenteroides.
The value of protons permeability of the wild cells of Leu. mesenteroides and Leu. paramesenteroides after an acid shock at pH 5.0 was 5.4 min. and 4.3 min., respectively. While the value of mutant cells of these strains was 8.4 min. and 4.8 min., respectively.
The pH of maximal specific activities of ATPase originated from the wild and mutant strains of Leu. mesenteroides were 0.87 unit/mg protein at pH 6.0 and 0.92 unit/mg protein at pH 5.5, respectively. The values of the wild and mutant strains of Leu. paramesenteroides were 0.59 unit/mg protein at pH 6.0 and 0.63 unit/mg protein at pH 6.0, respectively.
The results of pH dependency of glycolysis showed that the activity of mutant strains was higher than that of wild strainns. The mutant strains of Leu. mesenteroides and Leu. paramesenteroides were some more resistant to stronger acidity than the wild strains.
The release of magnesium ion from the mutant strains were observed about 12.8% for Leu. mesenteroides and 27.3% for Leu. paramesenteroides at pH 4 after 2 hours. The wild strains of Leu. mesenteroides and Leu. paramesenteroides released Mg^(+-) about 27.6% and 52.f%, respectively, under the same conditions.
The content of oleic acid a membrane fatty acid was reduced while the nonadecanoic acid content was increased, as acid tolerance increased. Therefore, it was considered that changes of oleic acid and nonadecanoic acid were closely related to the acid tolerance of the mutant strains of Leu. mesenteroides and Leu. paramesenteroides.
In conclusion, Adipic acid, a reagent having activity of inhibiting the growth of lactic acid bacteria, was added In the process of kimchi. Mutant strains (0.005%) of anti~adipic acid, Leu. mesenteroides and Leu. paramesenteroides, was also added with the ratio of 1 : 10. The kimchi containing adipic acid and mutant strains was fermented at 10℃ to investigate pH, total acids, senses.
The above experimental results of testing kimchi containing the two mutant strains showed that the taste of kimchi was more acceptable than the kimchi containing the wild strains based on the results of a delayed acidification, improved organoleptic test and extended edible period.

목차 (Table of Contents)

• 목차 = ⅰ
• Abbreviation = ⅴ
• List of Tables = ⅵ
• List of Figures = ⅶ
• ABSTRACT = xii
• Ⅰ. 서론 = 1
• Ⅱ. 연구사 = 4
• Ⅲ. 재료 및 방법 = 10
• 1. Adipic acid의 김치 젖산균종에 대한 생육저해능 = 10
• 가. 사용균주 = 10
• 나. 사용배지 및 배양방법 = 10
• 다. 균체 증식도의 측정 = 10
• 라. Adipic acid의 생육저해실험 = 11
• 2. 김치에 adipic acid 첨가 효과 = 11
• 가. 시료 김치의 제조 및 adipic acid의 첨가 = 11
• 나. 총산도 측정 = 12
• 다. 관능검사 = 12
• 3. Adipic acid 내성 변이균주 개발과 김치에의 첨가 효과 = 12
• 가. 사용균주의 배양 및 보관 = 12
• 나. Adipic acid 내성 및 내염성 확보를 위한 변이처리 및 목적균 선별 = 13
• 다. 균주의 생리화학적 특성 = 13
• 1) 그람염색 및 포자 형성 유무(58) = 14
• 2) Catalase 활성(58) = 14
• 3) Dextran 생성(59) = 14
• 4) Esculin 가수분해(58) = 14
• 5) 6.5% sodium chloride 농도에서의 성장여부(60) = 14
• 6) Urease 시험(58) = 15
• 7) Arginine 가수분해(58) = 15
• 8) Peptone base 시험(60) = 15
• 9) 항생물질 내성(61~63) = 15
• 10) 당질자화성(64~70) = 15
• 11) 운동성(59) = 15
• 라. 조직감의 측정 = 16
• 마. 유기산의 분석 = 16
• 바. Starter용 adipic acid 내성 변이균주의 선발 및 첨가량 결정 = 17
• 4. 내 adipic acid로 개량된 starter용 변이균주의 내산성 특성 = 17
• 가. 생육도 측정 = 17
• 나. 수소이온 투과도 = 18
• 다. H^(+)-ATPase 활성 = 19
• 1) 조효소액의 조제 = 19
• 2) 활성측정 = 20
• 3) Protein 정량 = 20
• 라. Glycolysis = 20
• 마. Mg^(++) 해리도 = 21
• 1) 균체의 총 Mg^(++) 함량 = 21
• 2) pH profile에 따른 균체 Mg^(++) 해리도 = 22
• 바. 세포막의 지방산조성 = 22
• Ⅳ. 결과 및 고찰 = 24
• 1. Adipic acid의 김치 젖산균종에 대한 생육억제능 = 24
• 2. 김치 제조시 adipic acid 첨가효과 = 37
• 가. Adipic acid 첨가 농도에 따른 김치의 pH 및 총산도의 변화 = 37
• 나. Adipic acid 첨가농도에 따른 김치의 관능특성 = 40
• 3. Adipic acid 내성균주 개발과 김치발효에 첨가 효과 = 43
• 가. Starter 개량용 야생균주와 변이균주의 생화학적 특성 비교 = 43
• 나. Starter용 변이균주의 선발 및 첨가량 결정 = 46
• 다. 조직감 = 59
• 라. 유기산 함량 = 60
• 4. Adipic acid 내성으로 개량된 starter용 변이균주의 내산성 특성 = 65
• 가. Adipic acid 내성으로 개량된 starter용 변이균주의 adipic acid 첨가에 따른 생육도 = 65
• 나. Adipic acid 내성으로 개량된 starter용 변이균주의 내산성특성 = 75
• 1) 수소이온 투과도 = 75
• 가) Leu. mesenteroies 야생균주와 변이균주 = 75
• 나) Leu. paramesenteroides 야생균주와 변이균주 = 79
• 2) ATPase 활성 = 83
• 3) Glycolysis 활성 = 87
• 4) Mg^(++) 해리도 = 91
• 5) 세포막의 지방산조성 = 94
• 가) Leu. mesenteroides 야생균주와 변이균주 = 96
• 나) Leu. paramesenteroides 야생균주와 변이균주 = 96
• Ⅴ. 적요 = 103
• 參考文獻 = 106