Effect of cyclo (L-Phe-L-Pro) on the expression of rpoS, vvhA, and vvpE in Vibrio vulnificus

국문 초록 (Abstract)

인간에게 치명적인 패혈증을 일으키는 Vibrio vulnificus (패혈증 비브리오균)는 확산성 신호물질인 cyclo (L-Phe-L-Pro) (cFP)를 생산하여 분비한다. 본 연구실에서 실시했던 Next-Generation Sequencing (NGS)을 이용한 transcriptome analysis 결과를 통해 5 mM의 추가적인 cFP는 정지상 시그마인자인 RpoS와 elastase인 VvpE의 발현을 촉진한다는 것을 확인했다. 본 연구에서는 rpoS-lacZ 접합을 이용하여 cFP가 유전자 rpoS의 전사를 촉진하며, western blotting을 통해서 cFP가 RpoS의 총량을 증가시킨다는 것을 확인했다. 또한 cFP를 첨가하였을 때 RNAP의 β and β´ subunit가 rpoS promoter에 결합을 더 잘한다는 것을 ligand fishing을 통하여 알 수 있었다. 한편, gel shift assay를 통해 ToxR이 용혈소 유전자 vvhA 상단부 부분에 결합하는 것을 확인하였다. 본 실험실의 연구결과 ToxR은 cFP와 함께 유전자 toxU와 ompU의 전사를 촉진하였으므로, ToxRS가 cFP 농도가 높을 때 vvhA의 발현에 영향을 줄 것이라 생각했지만, vvhA-lacZ 접합을 통해 cFP가 ToxR과 무관하게 유전자 vvhA의 전사를 촉진한다는 것을 알게 되었다. 또한 Hemolytic activity를 측정하여 cFP가 Vibrio vulnificus 균의 hemolytic activity를 증가되는 것을 밝혔다. 이와 비슷하게 vvpE-lacZ 접합과 azocasein assay를 통하여 cFP가 elastase의 유전자 vvpE의 발현과 exoprotease activity를 증가시키는 것을 확인했다. 이러한 결과들을 통해서 cFP가 V. vulnificus안에서 유전자 rpoS, vvhA와 vvpE의 발현이 촉진된다는 것을 알 수 있었다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Vibrio vulnificus is a pathogen that has ability to cause fatal primary septicemia via raw seafood contaminated with this bacterium. V. vulnificus produces and secretes a small diffusible signal molecule cyclo (L-Phe-L-Pro) (cFP). Our laboratory previously reported a transcriptome analysis by NGS (next generation sequencing) to show the effect of cFP. The result showed that exogenous 5 mM cFP in V. vulnificus up-regulates the stationary phase sigma factor RpoS and elastase VvpE. This study showed that rpoS gene is activated by cFP as demonstrated by β-Galactosidase assay with rpoS-lacZ fusion. A western blotting result showed that the total amount of RpoS is increased by cFP. A ligand fishing showed that β and β´ subunits of RNAP bind to rpoS promoter in presence of cFP. A gel shift assay indicates that ToxR binds to the promoter of hemolysin gene vvhA, and previous study in our laboratory showed that toxU and ompU are induced by cFP in cooperation with ToxR. These suggested that ToxRS would activate the expression of vvhA when cFP concentration is high. However, β-Galactosidase assay with vvhA-lacZ fusion and hemolytic activity assay results showed that cFP up-regulates the expression of vvhA and hemolytic activity even without ToxR. β-Galactosidase assay with vvpE-lacZ fusion and exoprotease activity assay results showed that cFP increases the the expression of vvpE and exoprotease activity. Accordingly, these results demonstrate cFP activates the expression of rpoS, vvhA and vvpE in V. vulnificus.