Taq polymerase 발현 E.coli의 임상적용 연구 = Clinical application study of Taq polymerase expressed in E.coli

국문 초록 (Abstract)

Taq polymerase 는 호열성 세균인 Thermus aquaticus에서 얻은 고열에서도 활성을 유지할 수 있는 DNA 중합효소이다. Taq polymerase의 사용으로 DNA가 denaturation되는 고온에서도 DNA 가닥의 연장이 가능해 지면서 PCR 기술의 발전을 맞이할 수 있었다. 이러한 Taq polymerase는 대량 생산을 위해 E.coli에 plasmid를 이용하여 Taq polymerase를 발현하는 유전자를 재조합하여 삽입한 뒤 효소의 발현을 유도한다.
이후 Taq polymerase를 발현한 E.coli로부터 효소를 추출해 내어 정제하는 과정이 수반되는데, 본 연구에서는 재조합 유전자로부터 효소를 발현한 E.coli를 추출 및 정제 과정을 생략하고 PCR반응에 바로 사용해 보았다. MD polymerase는 고려대학교 분자진단연구실에서 제작한 Taq polymerase이며 E.coli에서 발현한 Taq polymerase를 별도로 추출 및 정제하지 않고 E.coli 그대로 PCR 반응에 사용할 수 있도록 만들어졌다. 본 연구에서는 MD polymerase의 유용성 검증을 위해 Target gene으로 HLA-B27을 대상으로 하는 PCR 검사를 수행하였다.
HLA-B27은 강직성 척추염과 유전적 연관이 강하다고 알려져 있기에, 초기 강직성 척추염 진단에 있어서 중요한 검사이다. 강직성 척추염은 청년기에 주로 나타나며 남성에게서 더 많이 발병하는 류마티스성 척추염의 일종이다. 척추 부위에 뻐근함과 통중이 있으며 염증반응 이후 척추뼈들이 일체화 되기도 한다. 추간판 탈출증과 다르게 아침 기상 직후 또는 휴식 이후에 통증이 오히려 심해지는 것이 특징이다. 강직성 척추염은 HLA-B27 유전자와 연관이 있지만 정확한 발병 기전은 알려져 있지 않다.
서울아산병원에서 HLA-B27 검사에 사용되고 있는 HLA-B27 PCR kit(Biosewoom)는 시판용 Taq polymerase를 사용하는 PCR 시약이다. 이 검사는 혈액검체로부터 추출한 gDNA의 HLA-B27 유전자를 증폭하여 해당 유전자의 존재유무를 확인할 수 있다. 해당 시약은 시판용 Taq polymerase가 개별 포장되어 제공되며, PCR 반응 직전 혼합하는 방식이기 때문에 MD polymerase가 발현된 E.coli와 시판용 Taq polymerase를 비교하기에 적절한 구성이다.
서울아산병원에서 2022년 6월부터 2022년 9월까지 HLA-B27 검사를 시행한 뒤 남은 잔여 검체를 사용하였다. 이중 양성 55개와 음성 55개를 임의로 선정하여 무작위 익명화를 한 뒤, 시판용 Taq polymerase로 검사한 PCR결과와 MD polymerase를 이용한 PCR결과를 비교하여 일치율 및 Cohen’s kappa value를 통해 두 시약의 PCR 증폭 결과에 대한 일치도를 평가하였다.
총 110개의 검체에 대한 일치도 평과 결과, 모든 검체에서 결과가 일치하였다. 일치율은 100%로 나타났으며 Cohen’s kappa value도 1.0으로 완벽한 일치도를 나타내었다. 본 연구를 통해, MD polymerase가 추출과 정제 과정 없이도 PCR 반응에서 기존 시판용 Taq polymerase와 유사한 성능을 보여준다고 생각할 수 있다.

목차 (Table of Contents)

• 국문 초록 i
• ABSTRACT iv
• 목차 vii
• 표 목차 ix
• 그림 목차 x
• 기호 설명 xi
• I. 서 론 1
• II. 연구 재료 및 방법 5
• 1. 검체의 준비 5
• 2. HLA-B27 PCR 7
• 3. MD polymerase 제작 9
• 4. HLA-B27 PCR mixture와 MD polymerase 의 최적 혼합 비율 설정 10
• 5. 일치도 평가 11
• 5.1 일치율 11
• 5.2 Cohen’s kappa value 13
• III. 결과 15
• 1. HLA-B27 PCR mixture와 MD polymerase 의 최적 혼합 비율 설정 결과 15
• 2. 일치도 평가 결과 18
• 2.1 일치율 비교 22
• 2.2 Cohen’s kappa value 23
• IV. 고찰 24
• 참고문헌 27