Mupirocin Resistance Plasmid Analysis of Methicillin Resistant Staphylococci isolates from Tertiary Hospitals in South Korea

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Staphylcocci(Staphylcoccus aureus and Coagulase negative Staphylococci(CNS))는 피부와 비강에 분포하는 보통의 상재균이며 심각한 감염증을 유발시키는 원인이 되기도 한다. Mupirocin은 주로 그람양성균, 특히 methicillin-resistanct S. aureus를 포함하는 S .aureus와 CNS에 효과가 있는 국소적, 제한적 범위의 항생제이다. 이 항생제 사용 증가는 병원 내 만연되어 있는 multi-drug resistant MRSA을 퇴치하고자 많이 사용하였기 때문이다. Mupirocin내성은 MIC값에 의해 mupirocin low-(MuL)와 high-level(MuH)으로 나눠진다. 특별히 MuH의 경우 mupA plasmid에 의해 매개되므로 그 내성의 전파는 항생제 내성에 있어서 큰 문제를 야기시킬 수 있다. 이 연구에서 우리는 3차 의료기관에서 분리한 10개의 MuH Staphylococci에서 추출한 mupA plasmid의 유전적특성을 조사하였다. 각 분리주는 다양한 plasmid pattern과 항생제 내성 pattern을 가졌다. Plasmid 기원인 mupA gene은 PCR로 확인하였고, 모든 MuH 분리주에서 1.65kb의 PCR 산물이 검출되었다. MupA 다형성 조사로 RFLP(Restriction fragment of length pattern)을 시행하였고 그 결과로 주로 3가지의 형태로써 4.2kb의 EcoRI fragment, 13kb의 HindIII fragment, 27kb의 ClaI fragment이 나타났다. 내성전이에서의 mupA plasmid의 상관관계는 filter-mating을 통한 conjugation 방법으로 조사하였다. 10종의 Staphylococci 중에서 S. aureus v030, S. aureus 6201, S. haemolyticus 9307 and S. epidermidis 6219는 filter-mating으로 mupA plasmid의 전이를 확인하였다. 이 내성 전이는 동종과 이종간에서 모두 이루어졌으므로, Staphylococci 균종간에서의 MuH 전파가 가능하다는 것을 알 수 있었다. 6.8kb의 EcoRI fragment와 mupA plasmid를 가진 S. aureus v030 transconjugant, v030-8,은 Cloning을 통한 염기서열을 분석하여 한 copy의 IS257이 mupA gene 앞에 있는 것을 확인하였고, 연속되어 있지는 않지만 다른 부위에서의 IS257 부분을 확인 할 수 있었다.
따라서, 우리는 국내 3차 의료기관내 mupirocin resistant Staphylococci 11주를 분리하였고, 그 mupA plasmid의 다형성을 RFLP로 확인하였다. Transconjugant v030-8의 염기분석을 통해 mupA plasmid앞에 IS257이 있는 것을 확인하여 전이와 연관이 있음을 알게 되었고, Filter-mating을 통해 mupA plasmid는 자신뿐만 아니라 다른 항생제 내성을 가진 plamid와 함께 전이되는 것을 보아 mupirocin resistance plasmid는 Staphylococci에서의 multi-drug resistance 전파와 관련이 있음을 알 수 있었다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Staphylococci(Staphylococcus aureus and coagulase negative Staphylococci(CNS)) are normal flora of the skin and nasal passage and one of the most common cause of serious infections. Mupirocin is a topical narrow spectrum antibiotic that is active against mainly gram-positive, especially S. aureus including methicillin-resistant S. aureus(MRSA) and CNS. Because of multi-drug resistant MRSA in hospital, mupirocin usage is increased more and more. There are two types of mupirocin resistance, Low level-(8<MIC≤256㎍/㎖) and high level-resistance(MIC≥512㎍/㎖). Particularly because the mupirocin high-level resistance is mediated by mupA plasmid the resistance spread can cause a big problem for antimicrobial resistance. In this study, we investigated the characterization of isolated mupA plasmid from the 10MuH staphylococci, which were isolated in tertiary hospitals. Each isolate had different plasmid and antibiotic resistance pattern. The mupA gene location was confirmed with plasmid DNA not in chromosomal DNA by PCR product of mupA loci. The restriction fragment of length pattern(RFLP) experiment of mupA plasmid revealed that three different polymorphs of mupA loci and the most prevalent polymorphs were EcoRI-hybridizing fragment of 4.2kb, HindIII-hybridizing fragment of 13kb and ClaI-hybridizing fragment of 27kb. The relation of mupA plasmid with the transfer of mupirocin resistant phenotype was stigated by conjugation experiment. Among the 10 staphylococci, S. aureus v030, S. aureus 6210, S. haemolyticus 9307, S. hominis 9309, S. epidermidis 6219 and S. epidermidis 9310 isolates were analyzed with by filter-mating and mupA plasmid was transferred to recipient with the other plasmid, these findings showed the mupirocin resistance could be transferred between same species and different species and so the rocin resistance can spread between Staphylococci. The ansconjugant v030-8, which having only mupA plasmid, was selected for mupA gene isequencing. The sequence data of 6.8kb EcoRI fragment in v030-8 had 257 sequence attached to mupA gene directly, we find IS257 in other EcoRI fragment. It suggested that IS257 is concerning with the sferable mupA plasmid.
Therefore, we selected mupirocin resistant staphylococci isolates in tertiary hospital. The mupA plasmid polymerphisms was confirmed with RFLP and transconjugant v030-8 with only mupA plasmid has IS257 in front of mupA gene by sequence analysis.
As the result, mupA plasmid can transferable with other antimicrobial agents so that mupirocin resistance in staphylococci was related of transmission with multi-drug resistance.

목차 (Table of Contents)

• CONTENTS = ⅰ
• Abstract = 1
• Introduction = 3
• Materials and Methods = 7
• Strains = 7
• Antimicrobial agents susceptibility = 7
• Detection of mupA gene = 8
• Plasmid DNA isolation and Restriction Endonuclease Pattern (REAP) = 9
• RFLP analysis of mupA locus = 9
• Conjugation by filter mating = 10
• Cloning and DNA manipulation = 11
• 1. MupA PCR product cloning. = 11
• 2. Transconjugant v030-8 plasmid cloning. = 11
• Results = 12
• Antimicrobial susceptibility of mupirocin resistant isolates = 12
• MupA gene location of staphylococci species. = 12
• Plasmid pattern and southern blot of MuH plasmid = 13
• Restriction Endonuclease Pattern (REAP) of MuH Staphylococci = 13
• RFLP polymorphism analysis = 13
• Transconjugation of mupA plasmid between Staphylococci spp. = 14
• Cloning and mupA sequence analysis = 15
• 1. mupA PCR product cloning. = 15
• 2. Transconjugant v030-8 plasmid cloing. = 15
• 3. Sequence analysis of mupA fragment. = 15
• Discussion = 28
• 국문요약 = 32
• References = 34