Effects of Nicotine and Smoking Exposure on Dopamine Transporter and Tyrosine Hydroxylase in Rat Midbrain

국문 초록 (Abstract)

Tobacco-smoking의 주 구성 물질은 증독성약물중 하나인 nicotine이다. 이 nicotine의 강화와 보상 그리고 행동활성 효과는 중뇌 도파민 신경에 의존해서 활성 된다. 중뇌 도파민 신경은 동기유발, 주의력, 보상, 강화, 행동활성 등을 조절한다. Dopamine transporter(DAT)는 시냅스 간극으로 분비되어진 도파민을 다시 dopaminergic 신경내로 특이적으로 re-uptake 시키는 막 단백질이며 Tyrosine hydroxylase(TH)는 중뇌에서 dopamine 합성의 중요한 rate-limiting 효소로 작용한다. 이렇듯 DAT와 TH는 중뇌의 substantia nigra compact (SNc)와 ventral tegmental area (VTA)에서 발현된다. 본 연구의 목적은 중뇌에서의 증요한 두 가지 주 조절 단백질인 DAT와 TH에서 nicotine과 smoking 처리에 의한 DAT mRNA와 TH 단백질의 발현 효과에 대해 알아보고자 한다. 실험방법으로는 Immunohistochemistry, in situ hybridization, Western blotting과 RPA(RNase protection assay)을 이용하여 중뇌와 선조체에서의 DAT mRNA와 TH 단백질 분포지역과 발현양상을 알아보았다.
DAT mRNA의 발현에서는 nicotine과 smoking 처리군에서 SNc와 VTA지역에서 상당히 증가되었으며 TH 면역반응은 nicotine 처리군에서 가장 높게 나타났으나 TH 신경 세포체는 nicotine 처리군에서 SNc와 VTA지역 모두에서 상당히 감소되었다. Western blotting의 실험결과 nicotine 처리군에서 SNc와 CPu에서는 양적 차이가 크지 않은데 반하여 VTA와 NAC에서 양적 발현 차이가 높게 나타났다. 또한 DAT의 발현 부위는 TH의 발현과 비슷하게 나타났으며 TH가 면역반응을 나타내는 신경 세포에 DAT mRNA가 발현되었다.
이 연구결과로 smoking과 nicotine은 DAT와 TH에 영향을 미치며 nicotine는 VTA로부터 NAc로 projection되어지는 dopaminergic 신경에 더 큰 영향을 미칠 것으로 여겨진다. 또한 이 결과로 smoking과 nicotine 처리로 인한 중독 효과에 있어서 mesolimbicdopaminergic 신경계가 더 중요한 역할을 수행하고 있음을 알 수 있다. DAT mRNA의 발현이 증가된 것은 다른 presynaptic과 postsynaptic과의 신경변화에 의해 이루어진 것으로 smoking과 nicotine 처리이후에 중뇌 dopamine 신경의과 활성에 의해 이루어진 것으로 제시 할 수 있다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Compelling enidence exists that tobacco-smoking represents a form of drug addiction to nicotine. The reinforcing and behavioural effects of nicotine depend on activation of midbrain dopamine neurones. Dopamine transporter (DAT) is a highly specialized membrane-spanning protein that aids in terminating dopaminergic neurotransmission by sodium-dependent re-uptake of dopamine (DA) released into synaptic clefts. Tyrosine hydroxylase(TH) is rate-limiting enzyme of dopamine synthesis in the midbrain. TH and DAT are expressed in the substantia nigra compact (SNc), ventral tegmental area (VTA). The object of these study was to determine the effects of nicotine and smoking exposure on the TH protein, DAT mRNA expression for two key regulatory proteins (TH, DAT) in the midbrain. TH immunohistochemistry examined with in situ hybridization that found TH protein and DAT mRNA binding sites in midbrain. Western blotting and RPA(RNase protection assay) examined that TH protein and DAT mRNA in midbrain.
DAT mRNAs were significantly increased in SNc and VTA of nicotine and smoking group. TH cell bodies were significantly decreased in SNc and VTA of nicotine group. TH protein were significantly increased in NAc and VTA of nicotine group. Those of smoking and nicotine tended is higher up-regulate on the DAT mRNA expression than control in the rat midbrain. DAT binding sites show a distribution pattern similar to TH. DAT mRNA is expressed in TH-containing neurons. The current data Suggest that smoking and nicotine influences on the TH protein and DAT mRNA expression in SNc and VTA. smoking and nicotine influences on the TH protein expression to be significantly higher in mesolimbic dopaminergic system than in nigrostriatal dopaminergic system. Nicotine stimulates nicotinic acety1choline receptors located presynaptica11y on dopaminergic projections from the VTA to the NAc and increases DA transmission. This increased DAT expression is accompanied by other presynaptic and postsynaptic neuronal changes, which collectively suggest that midbrain dopamine neurons are hypoactive after prolonged smoking and nicotine exposure.

목차 (Table of Contents)

• 목차
• LIST OF FIGURES = i
• LIST OF TABLE = iv
• 국문초록 = v
• I. INTRODUCTION = 1
• II. MATERIALS AND METHODS = 7
• 1. MATERIALS = 7
• (1) Animals and Tissue preparation = 7
• 2. METHODS = 8
• (1) In situ hybridization = 8
• (2) RPA(RNase protection assay) = 10
• (3) Immunohistochemistry = 12
• (4) Double In situ hybridization and Immunohistochemistry In situ hybridization in some cell = 13
• (5) Western blotting = 14
• 3. Data analysis = 15
• III. RESULTS = 16
• 1. Effects of smoking and nicotine on the expression DAT mRNA = 17
• (1) Localization of DAT mRNA in midbrain = 17
• (2) RPA(RNase protection assay) = 18
• 2. Effects of smoking and nicotine on the expression of TH protein = 19
• (1) TH Immunohistochermisty = 19
• (2) Western blotting on the TH = 20
• 3. Distribution pattern of DAT binding sites and TH immunoreactive = 21
• (1) colocalization DAT mRNA and TH immunoreactive neurons = 22
• 4. Changes of doparnine receptors in CPu and NAc = 23
• IV. DISCUSSION = 24
• V. CONCLUSIONS = 29
• REFERENCES = 30
• ABSTRACT = 41