Enterohepatic circulation kinetics of bile non-methylated active folate derivatives in folate homeostasis in rats : identification, quantification and role of 5,10-methylenetetrahydrofolate, tetrahydrofolate, 10-formyltertrahydrofolate and 5-methyltetrahydrofolate as major active bile falate derivatives

국문 초록 (Abstract)

활성엽산유도체는 생체아미노산 및 핵산합성의 조효소로서 특히 DNA 합성 저해 antifolate 항암제의 작용기전에 중요한 연구대상이다. 생체내에서는 장간순환기구가 체내엽산대사의 대부분을 차지할 정도로 큰 저장기구를 유지 하며 체내 각 조기에 공급하며 세포증식에 관여한다. 지금까지는 이러한 순 환기구의 주활성유도체로서 5-메칠형엽산유도체(5-methyltetrahydrofolic aci-d, 5MF)가 존재하며 이러한 엽산대사의 항상성을 유지하는 것으로 알려져 왔으나 본 연구를 통해 5MF외에도 비메칠형유도체로 환원형엽산유도체(tetra-hydrofolic acid, THF), 10-포르밀유도체(10-formyltetrahydrofolic acid, 10HCO)와 5,10-메칠렌유도체(5,10-methylenetetrahydrofolic acid, 5,10CH2) 도 담즙중 대량으로 분비되며 소화관 재흡수를 통해 엽산대사의 체내 항상성 유지 기구에 중요한 역할을 수행하고 있다는 것을 약물 동태학적 이론을 응용하여 세계최초로 밝혔다. 이러한 물질의 동정은 HPLC-ECD(전기화학검출)를 이용하여 용출시간과 hydrodynamic voltammograms에 근거하고 Photodiode arr-ay 검출의 흡광프로화일에 근거하였다. 이러한 활성유도체의 정확한 정량 을 위해 HPLC-ECD 법을 이용하여 동시정량법을 개발하였다. 페닐컬럼을 도입 하였고 ECD의 인가전압을 350mV을 선택하였으며 항산화 및 유도체간 전환방 니를 위해 ascorbate와 포르말데하이드를 적용하였다. 기존의 분석방법에 비 해 월등한 감도와 회수율 높은 재현성 등 양호한 분석 파라메터를 나타내었 다. 이러한 동시정량법을 토대로 활성엽산유도체의 demethylenation 및 degra-dation kinetics를 규명할 수 있었으며 랫드 담즙을 대상으로 정량결과 5MF,5,10CH2, THF와 10HCO의 담즙배설 속도는 각각 436,427,267과 383 ng/hr으로 분석되어 5MF외에도 5,10CH2, THF와 10HCO도 주요 유도물질로 분비되는 것으 로 밝혀졌다. 담즙으로 배설된 이 비메칠형 유도체의 역할을 규명하기 위해 in situ 소화관 흡수시험법과 체외담관유도법을 이용하여 검토하였는데 체내 항상성유지기구에 대한 파라메터로 순환계 혈액의 주 유도체인 5MF를 정량 하여 문맥경유 흡수과정을 증명하였다. 담즙의 체외배설시 급격한 혈중 5MF 의 결핍을 초래하였지만 각각의 유도체를 총배설속도로 주입시켜 5MF의 혈중 동태를 해석한 결과 5MF 외에도 비메칠형인 5,10CH2, THF와 10HCO도 혈중 5MF의 유지에 각각 중요 역할을 할 수 있다는 것이 증명되었다. 그리고 이러 한 비메칠형유도체의 발생기전으로 혈중 5MF와 비활성산화유도체의 재활용의 가설을 세워 5MF와 folic acid(FA) 를 각각 정맥투여 후 담즙배설동태 및 클 리리언스를 산출해 본 결과 담즙 중 비메칠형유도체의 의존성은 5MF보다 FA 에 크게 의존한는 것으로 나타나 체내에서 소비후 생성되는 산화형유도체의 재활성와를 위해 소화관에서 methylation 시키기 위한 일련의 과정이 아닌가 하는 결과를 시사하였다. 이러한 유도체의 장간순환동태를 몇몇 동물에서 비 교검토해 본 결과 양적질적 분포차가 동물종산의 현격한 차이를 보여 엽산의 대사 및 체내항상성유지기구가 동물 종간에 큰 차이가 있음을 제시하였다. 엽산대사관련 항암제의 독성 가운데 급격한 혈중엽산의 결핍도 초래하는 문제 가 있는데 이러한 독성의 발생기전 연구의 하나로 항암제 methotrexate와 5- fluorouracil 을 투여 후 동정된 상기의 유도체의 담즙 중 배설동태도 조사해보았는데 유의적 영향을 주지 않았는데 이러한 결과를 혈중 엽산결핍의 원인 으로 담즙배설과정 보다는 소화관 흡수과정에 의한 것이 가능성이 높다는 것 을 시사한다. 이상의 연구결과 엽산대사의 체내항상성유지기구에 대해 장간 군환을 통한 비메칠형활성유도체의 종류와 역할이 동태론적으로 증명되어 기 존의 이론의 수정이 불가피하게 되었다. 따라서 본 연구는 새로운 유도체의 증명, 동시정량법의 개발, 역할을 규명, 종간의 비교와 관련대사약물의 영향 그리고 새로운 모델의 제시 등의 과정으로 진행되었으며 약 10여편의 연구 논문으로 정리 보고되었다.