소염진통제 등의 심혈관계 안전성 예측을 위한 생체지표 발굴연구 = Discovery of cardiovascular safety biomarkers induced by NSAIDs

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Newly developed drugs are being withdrew from the market due to their cardiovascular problem, and some of them are usually removed during the preclinical or clinical evaluation. In particular, many antibiotics or non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) have been withdrew from the market or posted to be cautious in use. In this study, we determined the effect concentration of seven NSAIDs (celecoxib, rofecoxib, naproxen, ibuprofen, diclofenac, meloxicam and valdecoxib) using the electophysiological method and specifically regulated mRNA or proteins in NSAID-treated myocardicytes using DNA chip or proteomics, respectively. We have determined the concentration as follows, 1) electrophysiological methods in the primary myocardiocytes isolated from neonatal rat. 2) inhibitory analysis in HERG channel, 3) cytotoxicity in cells. We carried out DNA microarray three times repeat at three concentration (1X, 1/5X, 1/25X), at 6 and 24 h after drug treatment. In addition, we analyzed the membrane proteins specifically changed in NSAID-treated myocardiocytes using proteomic technology. We investigated the relative protein expression pattern in each case in the PDQuest software and identified some of them using MALDI-top mass spectrometry. From this study, we obtained the eletrophysiological evaluation , mRNA or protein profile of each NSAID drug. Herein we briefly summarize the results. Celecoxib and diclofenac inhibited the delayed rectified K⁺ channel and L-type Ca²⁺ channel, respectively, and Valedecoxib specifically blocked the HERG channel. According to proteomic analysis, seven NSAIDs showed the similar effect on the protein expression in myocardiocytes although celecoxin and valdecoxib caused about 2 fold more decrease of protein expression than other 5 NSAIDs. The major proteins differentially expressed are mitochondial proteins, cytoskeletal, muscle contraction, signalling or Golgi ER structure proteins. In the DNA chip, we observed the gene expression profile of Ca²⁺ or K⁺ channel related genes and also signaling genes were dramatically changed. The profiles of mRNA or proteins might provide important information for safety evaluation of NSAIDs.

국문 초록 (Abstract)

최근 의약품 개발과정 중에 실시되는 기존의 비임상 및 임상시험으로는 쉽게 확인되지 않는 치명적인 심혈관계 부작용으로 인해 항균제, 소염진통제 중 일부 의약품이 시장에서 퇴출되거나 사용상의 주의사항에 경고문구가 강화되고 있다. 이에 본 연구에서는 심혈관계 부작용이 보고된 소염진통제 및 동일 계열의 대조약물 등 7종의 약물 (Celecoxib, Rofecoxib, Naproxen, Ibuprofen, Diclofenac, Meloxicam, Valdecoxib)을 전기생리학적 실험기법을 이용하여 처리농도를 결정하고, 약물을 처리한 후, 심근세포에서 발현되는 전사체 및 단백체를 분석하였다. 약물의 처리농도를 결정하기 위하여, 1) 초대배양 심근세포에서의 전기생리학적 분석, 2) HERG 채널 억제효과 분석, 3) 세포독성 분석의 세가지 방법을 통하여 소염진통제 7종의 처리할 기준농도를 결정하였다. 초대배양 심근세포에 약물 기준농도의 1, 1/5, 1/25의 3가지 농도를 처리하여, 처리후 6시간, 24시간의 시간대에서, 3번 반복하여 DNA microassay 실험을 수행하였다. 또한 이들 7종의 소염진통제를 초대배양 심근세포에 약물기준 농도를 처리하여 24시간 후, 이차원 전기영동을 사용하여 약물에 의한 단백질 발현 패턴을 평가하고 단백질 발현 프로파일을 확보한 후, PDQuest software를 활용하여 각각의 약물 투여군에서 비투여군보다 3배 이상의 발현량 변화(증감)을 보이고 그 발현정도가 약물농도에 의존성을 보이는 단백질을 분석하여 이를 질량분석기를 이용하여 동정하였다. 본 연구결과를 통해 심혈관계 부작용이 보고된 소염진통제 및 동일계열 대조약물 등 7종의 약물에 의한 전기생리학적 평가를 완료하였으며 전사체, 단백체 프로파일을 확보하였다. 결과를 요약하면, 전기생리학적 평가를 통하여 Celecoxib와 Diclofenac은 각기 delayed rectified K⁺ 채널과 L-type Ca²⁺ 채널활성을 저해하였으며, Valdecoxib는 HERG 채널억제효과가 있음을 확인하였다. 또한 7종 약물 처리에 의한 전체 단백질 수의 변화는 매우 유사하였으나, celecoxib와 valdecoxib는 감소하는 단백질 수가 다른 5종의 약물에 비하여 약 2배 이상 증가하였다. 발현량 변화를 보인 단백질의 대부분은 mitochondrial 단백질, 세포골격 구성 단백질, 근육 수축 관련 단백질, 신호전달 관련단백질 및 ER, Gogi structure 관련 단백질 이었다. 유전체 분석을 통하여, Ca²⁺ 채널 및 K⁺ 채널 관련 유전자의 발현변화 외에도 신호전달 관련 유전자의 변화를 보였으며, 이는 소염진통제가 이온채널의 직접적인 활성저해 뿐 아니라, 유전자 및 단백질 발현 변화와 같은 간접적 경로를 통해 심부정맥을 유발할 가능성을 제시하였다. 이러한 소염진통제의 전사체, 단백체 프로파일을 database화하여 의약품 안전관리에 이용하고 소염진통제의 심혈관계 안전성 지표 발굴의 기초자료로 활용함과 더불어 향후 소염진통제제의 부정맥 유발 관련 안전성 유효성 심사평가 기준으로 제시하고자 한다.