Stimuli-Responsive Synthetic Polymer Bioconjugate Hybrid Nanocarriers for Controlled Drug Delivery = 약물 전달 제어를 위? 자극-응답성 합성 고분자 생체적합체 하이브리드 나노 운반체

국문 초록 (Abstract)

암은 심혈관 질환을 제외한 현 문명사회 죽음의 두 번째 주요 원인이다. 최근 통계에 의하면 앞으로 20년 뒤에는 암이 심혈관 질환을 추월하고 첫 번째 주요 요인이 될 것으로 예상된다. 따라서, 새로운 항암제 개발에 대한 관심은 점차 증가해 왔고, 약물 제형에 관한 연구가 전 세계적으로 진행되고 있다. 항암치료에서 종양 세포 안으로의 효과적인 치료 흡수는 핵심적인 요구사항이며, 오늘날까지도 충분히 달성되지 못했다.
화학요법은 암에 대해 효과적이고 중요한 치료 방법이다. 기존의 화학치료제는 낮은 용해도, 낮은 종양 표적성, 세포 내 약물 흡수 부족, 낮은 치료효율 및 정상세포에 대한 세포 독성과 같은 바람직하지 않은 특성들로 인해 한계를 가지고 있고, 이러한 특성들은 암 치료 실패의 원인이 된다. 이러한 단점을 극복하는데 있어 고분자 나노수송체와 생체접합고분자는 다양한 나노수송체 제조에 중요한 역할을 한다. 이 중에서, 자극-응답성 나노수송체와 리간드로 둘러싸인 나노수송체는 정상세포보다 암세포의 치료를 촉진하는 암세포 특이성을 이용해왔다.
고분자 나노수송체는 수성 환경에서 향상된 용해도를 가지고, 항암제의 순환 시간이 길어지기 때문에 항암 치료에서 잠재적 가능성을 지닌 양식이다. 또한 이들은 입체 안정성을 통한 순환 시간의 연장과, 향상된 투과성 및 유지 효과에 의해 암 부위에 더 많은 약물이 전달 되도록 한다. 생물학적 반응 거동(낮은 pH, 글루타티온(GSH) 향상 및 특수효소)을 모방하는 것을 목표로 하는 자극-응답성 고분자들을 개발하는 것은 몸 전체에 영향을 주는 독성을 최소화하고 약물전달 효율을 향상시키는데 특히 유용하다.
이 논문에서는 종양에 약물전달을 효율적으로 유도하기 위해, 다양한 자극응답성 생체접합고분자와 나노수송체 화합물의 제조를 설명하고 있다. 생체적합성을 개선시키기 위해, (ⅰ) 우리는 생체적합성 고분자에 인지질 또는 인지질 모방 부분을 가지는 폴리텝타이드를 포함시켰다. (ⅱ) 폴리히스티딘 [p(His)], poly(N-isopropylacrylamide) [p(NIPAM)], 산 분해성 폴리아세탈 및 시스타민 링커를 가진 산화환원 반응성 다이설파이드와 같은 자극 응답성 고분자들을 다양한 합성 경로에 의해 합성하여 새로운 거대 분자 구조에 포함시켰다. (ⅲ) 엽산 (FA) 으로 둘러싸인 나노수송체는 종양 특이적 약물전달을 위해 제조되었다. 또한, 암세포 내부로 치료제 전달을 향상시키기 위해 (ⅳ) 이중 자극-응답 나노수송체 (pH/온도, pH/산화환원)를 제조했다.
합성적 측면에서는, 제어 리빙 라디칼 중합 (CLRP)과 클릭 화학의 조합과 같은 기존의 중합법을 결합하는 방법으로 자극-응답성 나노수송체 (미셀, 소포 및 폴리머좀 등) 제조를 위한 스마트 생체접합고분자를 합성하였다. 폴리펩타이드를 함유한 생체접합고분자는 합성 고분자 같은 거대개시제 또는 인지질의 아민 말단을 사용한 N-카복시 무수물 (NCAs)의 개환중합에 의해 합성되었다. NCA 단량체들은 트리포스젠 또는 오염화 인을 가지는 각각의 아미노산 유도체를 처리하여 합성했다. 주쇄가 산가수분해성 또는 생환원성에 의해 분해되는 고분자들은 일반적으로 폴리우레탄 합성 후에 뒤이어 생체적합성 향상을 위한 인지질 말단치환을 통해 합성되었다. 고분자의 구성과 구조적 성질은 다양한 분광기법과 GPC를 사용하여 연구하였다.
생체접합고분자 화합물 시스템은 미셀, 소포 및 폴리머좀과 같은 다양한 나노구조를 각각의 적절한 용매조건에서 제조할 수 있도록 한다. 일반적으로 미셀의 친수성 구조는 코로나처럼 미셀의 바깥 부분을 구성하고, 소수성 부분은 미셀의 안쪽 핵을 구성한다. 나노수송체 제조는 일반적으로 나노침전 및 용매교환 투석에 의해 수행된다. 주사전자현미경(SEM), 투과전자현미경(TEM), 핵자기공명(NMR), 및 동적광산란(DLS)를 사용하여 안정적인 나노구조를 분석하였다. 소수성 핵은 독소루비신 (Dox), paclitaxel, chlorine e6 (Ce6)과 같은 다양한 소수성 약물에 대응할 수 있다. 고분자 미셀의 크기는 블록공중합체의 소수성 및 친수성 분절의 분자량에 따라 결정되고, 일반적으로 10~100 nm 크기를 가진다.
연구의 첫 번째 목적은, 온도-응답 미셀의 종양 표적 전달의 개발이다. 일련의 합성 생체접합고분자 하이브리드 재료는 엽산이 결합된 인지질-Poly(NIPAM) 화합물로 구성되어있고, NIPAM의 사슬 파편의 가역적 첨가와 이동 (RAFT) 중합과 인지질과 엽산의 Click 반응의 조합에 의해 합성된다. 3개의 다른 인지질 물질 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE), 대두유 레시틴 기초 L-α-phosphatidylethanolamine (SPE) 및 1,2-bis(10,12-tricosadiynoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanoxlamine (DCPE)은 PL-p(NIPAM)n (n=25, 40, 60) 하이브리드 물질을 얻기 위해 결합되었다. 독소루비신(Dox)은 자가조립 공정을 통해 미셀 안에 캡슐화 되었고, 다른 온도 조건 하에서 전달된다. Dox가 담지된 미셀의 항암작용은 KB 세포라인을 사용하여 평가했다. 약물 방출 능력을 향상시키기 위해, 이어지는 연구에서 pH/온도에 반응하는 이중 자극-응답 리포중합체 하이브리드 시스템을 개발하였다. 이 시스템은 포스파티딜콜린(PC)과, pH 응답성을 가지는 포스파티딜에탄올아민-폴리히스티딘 (PE)-p(His) 복합체, 온도 응답성을 가지는 FA 결합 PE-p(NIPAM) 복합체로 구성되었다. 결과적으로 Ce6를 캡슐화한 소포체인 나노입자는 pH와 온도에 따라 각각 다른 세포 흡수, 세포 내 분포를 보이고, 다른 온도 및 pH 조건에서 KB 종양세포에 대한 광독성도 Ce6를 포함하지 않는 것과 비교하여 차이를 확인하였다.
이 외에도 pH-응답적인 미셀의 팽창을 제외한, 산분해성 나노수송체 또한 항암제를 세포 내로 전달하는데 뛰어난 방법이다. 이러한 방법을 연구하기 위해, 폴리아세탈로 말단 치환된 생체적합성 인지질 시리즈를 축합 중합반응을 통해 합성하였다. 우리는 낮은 pH에서 아세탈 결합이 분해되는 것을 생체접합고분자에 효과적으로 적용하였고, 따라서 암세포의 세포 내 환경 (엔도솜과 라이조솜, pH ≤6.0)에서 쉽게 분해될 수 있다. 시험관 내부 그리고 생체내부 결과는 혈중 순환시간이 길다는 것을 보여주었다; 이에 덧붙여, 조직학적 분석과 생체 내부 생화학적 분석 결과들은 새롭게 합성된 인지질 말단 치환된 하이브리드 미셀의 생체적합성을 나타내었다. GSH-응답 이황화 결합을 가진 나노수송체는 암세포의 세포 내 산화환원 환경 특성 (높은 GSH 농도, ≥ 10mM)을 이용하여 항암제를 세포 내로 전달하는 전도유망한 방법 중 하나로 여겨진다. 이에 따라 우리는 Dox의 산화 환원 응답적인 전달을 위해 주쇄에 이화황 결합을 가지는 생체환원적 폴리우레아의 양 말단에 인지질이 치환된 고분자 물질을 제조하였다. 이 연구는 이화황 결합이 없는 대조 샘플과 비교한 결과 또한 포함하고 있다. 무엇보다 중요한 것은, 세포 내 흡수 연구에서 이화황이 함유된 하이브리드 미셀은 정상 세포인 HEK394ft 보다 암세포인 HCT15와 HCT116에서 활발하게 분해되는 경향을 보인다는 것이다. Dox가 담지된 이황화 결합을 가지는 미셀의 분해를 조절함으로써 세포 내재화를 유도하고, 정상 세포 보다는 암세포에서 항암 활성을 향상시켰다.
본 연구에서는 pH 및 GSH 같은 암세포의 두 가지 내인성 자극을 이용하여, 세포 내 환경으로 Dox의 전달을 촉진시키는 방법을 개발하였다. 이를 위해 우리는 RAFT와 개환중합(ROP) 방법을 접목시켜 독창적인 p(MPC)25–b–p(His)n (n = 20, 35, 50, 75) 신 물질을 성공적으로 합성 및 개발하였다. 설계적 특징은 미셀의 p(MPC) 껍질처럼 생체적합성 및 비 트롬보겐성 (thrombogenicity) 제공여부와 같은 고려사항들을 기반으로 하였다. pH-응답적인 미셀의 p(His) 핵은 미셀의 엔도조말 불안정성을 보이고, 암세포에 고유한 표적성을 가진다. 또한, 이화황 가교된 p(MPC) 껍질은 GSH 농도 증가로 인해 암세포의 세포내 세포액에서 분해 된다.
일반적으로, 자극 응답성 인지질 또는 생체접합 고분자를 포함한 인지질 모방 유사체 시리즈는 나노수송체들의 다양한 항암성 약물 전달을 위해 제조되었다. 각 장에서는 상세한 특성과 분석에 대해 논의 할 것이다. 합성 방법과 그들의 생체 의학적 응용은 시험관 내에서 뿐만 아니라 생체 내부에서도 적절한 실험적 배경을 기반으로 하여 설명하였다.

목차 (Table of Contents)

• CHAPTER 1. INTRODUCTION 1
• 1.1 Significance of polymeric nanomedicine in anticancer therapy 2
• 1.2 Stimuli-responsive nanocarriers 6
• 1.2.1 pH-responsive nanocarriers 8
• 1.2.2 Temperature-responsive nanocarriers 13
• 1.2.3 Redox-responsive nanocarriers 15
• 1.2.4 Other stimuli-responsive nanocarriers 17
• 1.2.5 Dual or multi stimuli-responsive nanoacrriers 23
• 1.3 Polypeptide bearing nanocarriers 25
• 1.4 Phospholipid bearing nanocarriers 27
• 1.5 Significance of targetd anticancer therapy 29
• 1.6 Photodynamic therapy and imaging in anticancer therapy 30
• 1.7 Recent fronteriers in polymer synthesis 31
• 1.7.1 Conventional polymerization 32
• 1.7.2 Controlled radical polymerization 34
• 1.7.3 Ring opening polymerization of α-amino acid N-carboxyanhydrides 40
• 1.7.4 Click chemistry in polymer science 43
• 1.8 Scope, aim and outline of the thesis 49
• 1.9 References 53
• CHAPTER 2. FOLIC ACID-TETHERED POLY(N-ISOPROPYLACRYLAMIDE)PHOSPHOLIPID HYBRID NANOCARRIERS FOR TARGETED DRUG DELIVERY 69
• 2.1 Introduction 70
• 2.2 Experimental 73
• 2.3 Results and discussion 83
• 2.4 Conclusions 103
• 2.5 References 104
• CHAPTER 3. DUAL STIMULI-RESPONSIVE VESICULAR NANOSPHERES FABRICATED BY LIPOPOLYMER HYBRIDS FOR TUMOR-TARGETED PHOTODYNAMIC THERAPY. 108
• 3.1 Introduction 109
• 3.2 Experimental 112
• 3.3 Results and discussion 125
• 3.4 Conclusions 148
• 3.5 References 149
• CHAPTER 4. PHOSPHOLIPID END-CAPPED ACID-DEGRADABLE POLYURETHANE MICELLES FOR INTRACELLULAR DELIVERY OF CANCERTHERAPEUTIC 155
• 4.1 Introduction 156
• 4.2 Experimental 159
• 4.3 Results and discussion 168
• 4.4 Conclusions 190
• 4.5 References 191
• CHAPTER 5. PHOSPHOLIPID END-CAPPED BIOREDUCIBLE POLYURETHANE NANOCARRIER FOR INTRACELLULAR DELIVERY OF DOXORUBICIN INTO TUMOR CELLS 195
• 5.1 Introduction 196
• 5.2 Experimental 199
• 5.3 Results and discussion 207
• 5.4 Conclusions 225
• 5.5 References 226
• CHAPTER 6. BIOMIMETIC PH/REDOX DUAL STIMULI RESPONSIVE POLY(2METHACRYLOYLOXYETHYL PHOSPHORYLCHOLINE)BLOCKPOLY(LHISTIDINE) HYBRID MICELLES FOR THE INTRACELLULAR DELIVERY OF DOXORUBICIN INTO TUMOR CELL COMPARTMENTS. 230
• 6.1 Introduction 231
• 6.2 Experimental 235
• 6.3 Results and discussion 243
• 6.4 Conclusions 258
• 6.5 References 258
• CHAPTER 7. CONCLUSION AND FUTURE PERSPECTIVES 263
• ABSTRACTS 271
• AKNOWLEDMENTS 286
• LIST OF PUBLICATION 291
• CURRICULUM VITAE 300