피브리노겐 중앙 도메인과 αXβ2, αMβ2의 결합 특성 분석 = Fine mapping of fibrin(ogen) central domain responsible for the binding to αXβ2 and αMβ2 integrins

국문 초록 (Abstract)

피브리노겐은 혈액 내 존재하는 주요 혈장 단백질로서 혈관에서 트롬빈에 의해 피브린으로 전환되어 혈전을 형성, 혈액 응고에 관여한다. 피브리노겐은 두개의 말단 도메인(distal domain)과 하나의 중앙 도메인(central domain)으로 구성이 되는데, 중앙 도메인과 양 말단 도메인이 ‘coild-coil’ 라고 불리는 stranded region에 의해 연결되어 있다. 이들 도메인은 이황화 결합으로 연결된 3 종류의 polypeptide chain(Aα, Bβ ,γ)으로 구성된다. 피브리노겐은 혈전 형성뿐 아니라 leukocyte 표면에서 발현되는 β2 인테그린과의 상호작용을 통해 염증반응에 다양한 영향을 끼치는 것으로 알려졌다. 피브리노겐은 leukocyte의 이동을 조절하고 phagocytosis, NF-kB mediated transcription, chemokine and cytokine 분비 등 leukocyte의 기능에도 관여한다. β2 인테그린은 특이적인 β2 소단위체(CD18)를 갖는 세포 막 관통 단백질로서 leukocyte 표면에서만 발현되는 leukocyte 인테그린으로 α 소단위체와 β소단위체가 비공유적으로 연결된 heterodimeric한 형태로 발현된다. β2 인테그린에서 리간드 인지에 결정적인 역할을 하는 α 소단위체는 리간드와 결합하는 I 도메인을 갖는다. I 도메인은 약 200여개의 아미노산으로 구성이 되며, 5-7개의 α herix가 5개의 β sheet를 둘러싸는 로스만 접힘(Rossman fold) 구조를 하고 있는데, 리간드와의 결합에서 주요 결합 자리로 작용한다. 지금까지 αMβ2, αXβ2 인테그린의 I domain이 피브리노겐의 말단 도메인과 결합하는 것으로 알려졌는데, 피브리노겐의 중앙 도메인과 αM I-domain, αX I-domain과의 결합은 밝혀진 것이 많지 않다. 이번 연구에서는 피브리노겐 중앙 E 도메인과 αMβ2, αXβ2 인테그린의 결합특성을 밝히고자, 피브리노겐의 central E 도메인 내에 존재하는 αM I-domain, αX I-domain과의 주요 결합자리를 solid phase analysis 와 surface plasmon resonance(SPR) analysis를 이용하여 확인 하였다. solid phase analysis 결과 피브리노겐 중앙 도메인의 β 사슬이 α chain보다 αM I- domain 및 αX I-domain과 더 많이 결합하는 것을 확인하였다. SPR 분석 결과 피브리노겐 중앙 도메인의 β 사슬이 αM I- domain 및 αX I-domain과 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다. 피브리노겐 중앙 도메인을 구성하는 짧은 peptide와 αM I-domain 및 αX I-domain 과의 결합 실험에서도 β 사슬의 B2 peptide(TGKKVERKAPDA)가 결합에 많이 관여하는 것을 확인하였다. B2 peptide 지역에서 점 돌연변이 주를 이용하여 αM I-domain 및 αX I-domain 과의 결합을 조사해 본 결과, 이 지역의 글루탐산 잔기가 중요한 기능을 하는 것을 확인 하였다. 이는 β 사슬이 그리고 B2 peptide 지역이 인테그린과의 결합에 결정적인 역할을 한다는 것을 의미한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Fibrinogen is a major blood plasma protein which is converted into fibrin to prevent blood leaks from blood vessels. Besides blood clotting, fibrinogen is involved in additional functions including platelet aggregation, leukocytes adhesion, and stimulation of cytokine release in macrophages. The interaction of human plasma fibrinogen with leukocyte integrin αMβ2 and αXβ2 supports the inflammatory response. It was demonstrated the binding of β2 integrin to central domain of fibrinogen besides of distal domains. As a next step, we investigated the region of fibrinogen central domain responsible for αM and αX I-domains by solid phase and surface plasmon resonance analysis. The β chain of the central domain of fibrinogen binds to αM and αX I-domains in a dose-dependent manner while α chain did not. The region of β chain containing the sequence(TGKKVERKAPDA) was found to bind αM and αX I-domains by the analysis of peptide binding. These results suggest that β chain is the critical binding site of fibrinogen central domain and leukocytes can mediates fibrinogen signaling through β2 integrin.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서론 = 1
• Ⅱ. 재료 및 방법 = 12
• 1. 균주 및 플라스미드 = 12
• 2. 배지, 제한효소 및 시약 = 12
• 3. Site directed mutagenesis를 위한 PCR(Polymerase Chain Reaction) = 13
• 4. Plasmid DNA 조작 = 13
• 4.1 DNA의 제한 효소 절단 = 13
• 4.2 DNA 절편의 순수 분리(GENE　CLEAN) = 14
• 4.3 삽입체와 운반체의 재조합 = 14
• 5. 대장균 형질 전환 = 14
• 6. Plasmid DNA의 소량 분리 (Miniplasmid prep) = 15
• 7. 과잉 발현의 유도 및 확인 = 15
• 8. GST-fusion protein 분리 = 16
• 9. Fibrinogen과 integrin binding analysis = 17
• 1)Solidphasebinding analysis = 17
• 2)Surfaceplasmonresonance(SPR)analysis = 17
• Ⅲ. 결과 = 22
• 1. αM I-,αX I-domain과 피브리노겐 fragmentE peptide의 결합 확인 = 22
• 2. 피브리노겐 fragmentE α,β 사슬의 발현 및 분리 = 22
• 3. αM I-,αX I-domain과 피브리노겐 fragmentE α,β 사슬의 결합 확인 = 23
• 4. 피브리노겐 fragment E β 사슬과 αM I-,αX I-domain의 결합 kinetics = 24
• 5. αM I-,αX I-domain과 피브리노겐 fragmentE β chain mutant protein의 결합 확인 = 24
• Ⅳ. 논의 = 36
• Ⅴ. 참고문헌 = 38
• 영문초록 = 43