아데노바이러스 벡터의 안전성평가에 관한 연구 = Studies on the safety valuation of adenoviral vector

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

1. Construction and purification of adenovirus
☞ To construct for recombinant adenovirus expressing LacZ gene, we used with the Adeno-X-expression system (BD, CA) and Adenovirus Expression Kit (Takara). The viruses were propagated in 293 cells and virus st.ocks were prepared by a CsCI standard procedure and Adeno-X virus purification kit (BD, CA). The seed RCA (adenovirus type 5) was purchased from A TCC (VR-1516).
2. Detection of RCA using restriction enzyme mapping
☞ The bands specifically derived from RCA were detected by the restriction enzyme, XhoI. There are another restriction enzyme, ClaI, SmaI, XbaI that are also used for the detection of the band derived from RCA.
3. RCA assay using A549 Cells
☞ A549 cells were obtained from the Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea). We compared with RCA detection by PCR and CPE assay. In PCR, RCA was detected in all 3 samples infected with pfu 1 on day 6. However, in CPE assay, CPE was observed in all 3 samples infected with pfu 100 on day 6.
4. Real-time quantitative PCR set up.
☞ To set up a real-time PCR that can quantify the copy number of RCA, we made primers and probes for the detections of E1. The threshold cycle and log-transformed concentration showed in a linearity from 10⁸ to 10¹. TaqMan probe was used In this experiment (Reporter; FAM, Quencher: TAMRA)
5. Detection of organic compounds in blood
☞ To examine how organic compounds change in rats following injection of adenovirus (LacZ gene expressing adenovirus, RCA), we analyzed blood in rats. Compared with control, palmitoleic acid, oleic acid, linolenic acid were increased about two times with infection of the viruses.

국문 초록 (Abstract)

1. Adenovirus vector의 제작과 정제
☞ 연구에 필요한 LacZ발현하는 adenovirus는 BD회사의 Adeno-X-expression system과 Takara회사의 Adenovinls Expression Kit을 이용하여 제작하였으며, CsCl법과 Adeno-X virus purification kit (BD, CA)를 이용하여 대량 정제하였음. 또한 RCA는 식양청에서 ATCC (VR-1516)로부터 구입한 것을 분양 받았음.
2. RCA 측정을 위한 제한 효소 mapping법의 확립
☞ XhoI 제한효소로 RCA를 측정하는 방법을 확립하였으며, 또한 앞으로 제한효소에 의한 RCA 검출법의 flexibility를 증가시키기 위해 E1 영역에 있는 후보제한효소 (예: ClaI, SmaI, XbaI)가 있음을 NEBcutter program 상에서 확인하였음.
3. A549세포를 이용한 RCA assay
☞ A549세포를 한국세포주 은행으로부터 구입하여 CPE와 PCR의 결과를 비교 검토하였음. PCR에서는 RCA가 pfu 1, 6일 경과 후에는 sample 3개 모두가 관찰되었고, CPE assay에서는 RCA가 pfu 100에서 6일 경과한 후 sample 3개 모두에서 관찰되었음.
4. Real-time PCR set up
☞ Applied Biosystem의 real-time PCR을 확립하여 RCA의 particle이 108에서 101까지 linearity가 있음을 확인하였음. 사용한 probe는 TaqMan을 사용하였으며, reporter로서 FAM, Quencher로서 TAMRA를 사용하였음.
5. RCA가 포함된 adenoviral vector particle의 독성분석과 adenovirus vector의 감염에 의한 혈액에서의 유기대사물의 변화측정
☞ 아데노바이러스에 감염된 rat의 혈액에서 palmitoleic acid, oleic acid. linolenic acid가 대조군 보다 약 2배정도 높게 검출되어 앞으로 이러한 지방산은 adenovirus의 감염지표로 사용이 기대됨.○ 연구목표
아데노바이러스 벡터가 효과적으로 유전자 치료에 사용되기 위해서는 아데노바이러스의 안전성 및 품질을 평가 할 수 있는 시험법과 평가 기준이 필요함. 특히, 아데노바이러스 벡터의 임상 적용을 대비하여 복제가능한 아데노바이러스를 검출할 수 있는 평가기술의 객관적인 측정 방법과 기준을 마련하여야 함. 본 연구는 아데노바이러스 벡터의 유전자 치료제로서의 안전성 기준 및 평가 방법을 확립하고, 그 안전성과 품질에 대한 기준을 제정하거나 개정하는데 필요한 방법을 확립하고자 함.
○ 연구내용
1). 아데노바이러스 벡터의 복제가능바이러스 벡터의 검출 시험법 확립
2). PCR을 이용한 복제가능한 아데노바이러스 벡터의 검출 시험법 확립
3). Adenoviral 벡터 주입에 따른 생체내 대사물질의 농도 변화 측정 및 혈액에서의 유기 대사물 변화의 측정을 통한 독성 분석
복제가능한 아데노바이러스를 정량적이고 직접적인 측정방법을 개발하기 위하여 제한효소 mapping, A549세포를 이용한 RCA 측정, real-time PCR을 이용하여 정확하게 RCA의 contamination을 측정하는 system을 구축하였음. 또한, 아데노바이러스 벡터의 감염을 유도한 흰쥐를 이용하여 생체내 환경의 지표가 되는 다양한 대사산물을 혈액에서 정량적으로 측정하고 대조군과 그 결과를 비교 분석 함으로서 생체내 농도 변화와 독성 여부와의 상관관계를 관찰하였음.
○ 연구성과(응용분야 및 활용범위포함)
RCA 검출을 분자생물학적 수준의 정확한 검사법이 확립(제한효소 mapping법, real-time PCR)과 A549세포를 이용한 생물학적인 RCA assay법이 확립되어 복제가능한 아데노바이러스의 오염 및 변화 여부를 쉽게 예측하고 분석할 수 있게 되어 유전자치료에 사용하게 될 아데노바이러스의 효율성뿐만 아니라 안전성 평가에 널리 활용될 수 있을 것임. 유전자치료에 있어서 가장 근본적인 문제의 하나인 안전성 재고를 위해 아데노바이러스의 감염에 의한 생체내 유기 대사 물질의 농도 변화를 프로파일링하여 palmitoleic acid, oleic acid, linolenic acid가 대조군에 비해 2배 증가하는 것이 관찰되어 이러한 유기지방산은 앞으로 생화학적 지표를 이용하게 되어, 치료용 아데노바이러스의 기본 요건을 제정하고 이용하는데 유용하여 향후 유전자 치료에 널리 활용될 것으로 기대됨.