재조합 소 성장 호르몬의 생화학적 특성 연구 = (The) Study of expression and renaturation of recombinant bovine somatotropin

국문 초록 (Abstract)

재 조합 소 성장 호르몬을 대장균에서 발현시키기 위하여 합성 유전자를 제조하여 대장균 발현 벡터 ptrp3H에 클로닝 하였다. 소 성장 호르몬 말단 부위의 2차 구조 형성을 막고, 발현률을 향상 시키기 위하여 연어 성장 호르몬의 일부서열을 소 성장 호르몬 유전자의 5’-말단에 접합시킨 2개의 cistron을 이용하는 시스템으로 완성하였다. 숙주로 가장 높은 발현률은 나타낸 것은 w3110이었다. 제조된 균체는 유가식 발효법을 이용하여 발현시켰다. 회수된 재조합 소 성장 호르몬 단백질 봉입체를 고 수률로 원상화 시키기 위하여 이소 프로필 알코올을 이용한 원상화 방법을 고안하였다.
소 성장 호르몬의 원상화를 위한 과정이 세단계로 나누어 연구되었다. 가용화 단계에서의 최적 조건은 이소 프로필 알코올 농도 35%, 온도 37℃, pH 12.4였다. 산화 단계의 최적 조건은 15% 이소 프로필 알코올, 2-머캅토 에탄올 0.01%, pH 11.7, 단백질 농도 2.5g/L, 온도 16℃였다. 이러한 조건에서 산화는 4시간이내에 완성되었다. 본 연구에서 산화제는 용존 산소였으며, 원상화 과정에서 수율에 영향을 미치는 가장 중요한 요소는 단백질 농도였다. 중첩은 이소 프로필 알코올이 투석이나 한외여과를 이용한 diafiltration 시 서서히 일어났다. 이소 프로필 알코올의 극성이 단백질 중첩의 속도에 영향을 미치는 것으로 보여지며 최적의 조건은 2~4%의 이소 프로필 알코올 농도였다. 중첩 시 고농도의 이소 프로필 알코올은 소수성 아미노산의 행동에 영향을 주어 2차 구조와 3차 구조 형성을 억제시켰다.
중첩의 전이 상태는 이소 프로필 알코올의 농도와 pH에 의하여 유도되었다. pH가 낮을수록 중첩의 속도가 증가하는 반면 이중체의 형성이 증가되었으며, 이소 프로필 알코올의 농도가 낮을수록 중첩의 속도가 증가하였다. 본 연구에서 확립된 이소 프로필 알코올 사용 방법을 사용하는 경우 소 성장 호르몬 봉입체의 원상화 수율은 거의 100%에 이르렇다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Synthetic bovine growth hormone (bGH) gene was cloned into E. coli expression vector system (ptrp3H). Bi-cistron system was introduced to the 5’-terminal region of the bGH gene to alter the secondary structure and to improve expression of the gene. Truncated salmon growth hormone gene was attached to 5’-terminal region of bGH gene. E. coli w3110 was selected as an efficient host strain. Transformed E. coli was cultured to produce r-bGH by fed-batch fermentation. Renaturation method of r-bGH inclusion body with iso-propyl alcohol was studied to set up the high yield generation method.
Study of r-bGH renaturation method was performed as 3 steps. Optimal condition for inclusion body solubilization was obtained in 35 % iso-propyl alcohol, 37℃, and pH 12.4. Optimal condition of oxidation step was 15 % iso-propyl alcohol, 0.01 % 2-mercaptoethanol, 2.5 g/L of protein concentration, 16℃, and pH 11.7. Oxidation was completed within 4 hours in this condition. In this method, oxidizing agent was dissolved oxygen and most important factor, have an influence on yield, was protein concentration. Folding was slowly proceeded during dialysis or diafiltration by ultrafiltration. Speed of protein folding was affected by polarity of iso-propyl alcohol, and optimal concentration of iso-propyl alcohol was 2~4 %. It appeared that formation of secondary and tertiary structure was inhibited by high concentration of iso-propyl alcohol by the way of disturbing the behavior of hydrophobic amino acids.
Transition state of folding intermediates was induced by concentration of iso-propyl alcohol and pH. Folding speed and dimer formation were increased by low pH. Folding speed was also increased by low concentration of iso-propyl alcohol concentration. It was confirmed that the renaturation yield could be reached to nearly 100% by this method.

목차 (Table of Contents)

• 목차 = ⅰ
• List of Figures = ⅶ
• List of Tables = ⅹⅰ
• List of Abbreviations = ⅹⅱ
• 제1장 The study of expression and renaturation of recombinant bovine somatotropin = 1
• Abstract = 1
• 초록 = 3
• Ⅰ. 서론 = 4
• 1. 성장 호르몬의 생리적 활성 = 4
• 2. 소 성장 호르몬의 연구 배경 및 활성 = 5
• 3. 소 성장 호르몬의 생산 연구 = 7
• 4. 소 성장 호르몬에 있어서 발현률 개선 연구 = 7
• 5. 단백질 재 중첩의 일반 사항 = 9
• 6. 성장 호르몬의 재 중첩 연구 = 10
• Ⅱ. 재료 및 방법 = 14
• 1. 유전자 재조합 대장균의 제조 = 14
• 1.1. 소 성장 호르몬의 클로닝(Cloning) = 14
• 1.2. 소 성장 호르몬 발현벡터의 제조 및 발현량 확인 = 15
• 2. 소 성장 호르몬 발현을 위한 발효 방법 = 17
• 2.1. 종 배양 (Seed Culture)1 = 17
• 2.2. 종 배양 2 = 17
• 2.3. 주 배양 (Main Cultivation) = 18
• 3. 소 성장 호르몬 봉입체(Inclusion Body)의 원상화(Renaturation) = 23
• 3.1. 재조합 소 성장 호르몬(Met-bST) 봉입체의 회수 = 23
• 3.2. 이소 프로필 알코올을 이용한 재조합 소 성장 호르몬의 원상화 = 24
• 3.2.1. 소 성장 호르몬 봉입체 가용화(Solubilization)를 위한 최적의 이소 프로필 알코올 농도 결정 = 24
• 3.2.2. 소 성장 호르몬 봉입체 가용화(Solubilization)를 위한 최적의 온도 결정 = 24
• 3.2.3. 소 성장 호르몬의 산화(Oxidation)를 위한 최적의 이소 프로필 알코올 농도와 환원제 농도 결정 = 24
• 3.2.4. 소 성장 호르몬의 산화(Oxidation)를 위한 최적의 pH 결정 = 25
• 3.2.5. 산화(Oxidation)를 위한 최적의 소 성장 호르몬 농도 결정 = 25
• 4. 소 성장 호르몬의 정제 = 26
• 4.1. 소 성장 호르몬 봉입체의 재 중첩 = 26
• 4.1.1. 요소에 의한 재 중첩/산화 = 26
• 4.1.2 이소 프로필 알코올에 의한 산화 = 26
• 4.2. 재 중첩된 소 성장 호르몬의 정제 = 26
• Ⅲ. 결과 = 28
• 1. 유전자 재조합 대장균의 제조 = 28
• 1.1. 합성 소 성장 호르몬 유전자의 클로닝 = 28
• 1.2. 소 성장 호르몬 발현 벡터의 제조 및 발현량 확인 = 29
• 2. 유가식 발효 방법을 통한 소 성장 호르몬의 발현 = 41
• 3. 소 성장 호르몬 봉입체(Inclusion Body)의 원상화 = 44
• 3.1. 재조합 소 성장 호르몬 봉입체의 회수 = 44
• 3.2. 이소 프로필 알코올을 이용한 재 조합 소 성장 호르몬의 가용화(solubilization) = 44
• 3.3. 이소 프로필 알코올을 이용한 소 성장 호르몬의 산화(Oxidation) = 45
• 3.4. 소 성장 호르몬의 정제 = 47
• 3.5. 소 성장 호르몬의 원상화 동력학 = 48
• Ⅳ. 고찰 = 64
• 1. 유전자 재조합 대장균의 제조 = 64
• 2. 유가식 발효 방법을 통한 소 성장 호르몬의 발현 = 65
• 3. 소 성장 호르몬 봉입체(Inclusion Body)의 원상화 = 66
• Ⅴ. 참고 문헌 = 70
• 제2장 The study of characteristics of recombinant bovine somatotropin and it s modified forms = 86
• Abstract = 86
• 초록 = 88
• Ⅰ. 서론 = 90
• 1. 디스아미도 변형체 = 90
• 2. 재조합 인간 성장 호르몬의 변형체 = 91
• 3. 소 성장 호르몬의 변형체 = 92
• 3.1. Acetylation 변형체 = 92
• 3.2. 디스아미도 변형체 = 92
• 3.3. Norleucine 변형체 = 93
• 3.4. Formylmethionine 변형체 = 93
• Ⅱ. 재료 및 방법 = 96
• 1. 정제된 재조합 소 성장 호른몬의 물리 화학적 특성 = 96
• 1.1 Size exclusion chromatography HPLC에 의한 순도 측정 = 96
• 1.2. Reverse Phase HPLC에 의한 순도 측정 = 96
• 1.3. SDS-PAGE에 의한 순도 및 분자량 측정 = 96
• 1.4. Western blotting에 의한 소 성장 호르몬 확인 = 96
• 1.5. Mass spectrometry에 의한 분자량 측정 = 97
• 1.6. Isoelectric focusing에 의한 pI의 측정 = 97
• 1.7. 흡광 계수(Extinction Coefficient)의 측정 = 97
• 1.8. UV 흡광도 측정 = 98
• 2. 정제된 재조합 소 성장 호르몬의 구조적 특성 = 98
• 2.1. 아미노산 조성 분석 = 98
• 2.2. N-말단 아미노산 서열 분석 = 98
• 2.3. C-말단 아미노산 서열 분석 = 99
• 2.4. Circular Dichroism(CD)에 의한 2차 구조 분석 = 99
• 2.5. 트립신에 의한 peptide mapping = 99
• 2.6. LC-mass에 의한 peptide들의 위치 확인 = 99
• 3. 정제된 제조합 소 성장 호르몬의 생물학적 활성 = 100
• 3.1. Hypophysectomized(hypox) rat을 이용한 몸 무게 증체 실험 = 100
• 3.2. 비유기 젖소에서의 산유량 증가 시험 = 100
• 4. 변형된 소 성장 호르몬의 확인 = 100
• 4.1. 2차원 전기 영동에 의한 확인 = 100
• 4.2. LC mass에 의한 확인 = 101
• 5. 변형된 소 성장 호르몬의 정제 = 101
• 6. 변형된 소 성장 호르몬의 생물학적 활성 = 102
• 7. 발효 방법의 최적화를 통한 변형체 생성의 최소화 = 102
• Ⅲ. 결과 = 103
• 1. 물리 화학적 특성 = 103
• 1.1 Size exclusion chromatography(SEC) HPLC에 의한 순도 측정 = 103
• 1.2. Reverse Phase(RP) HPLC에 의한 순도 측정 = 103
• 1.3. SDS-PAGE에 의한 순도 및 분자량 측정 = 104
• 1.4. Mass spectrometry에 의한 분자량 측정 = 105
• 1.5. 등전위점의 확인 = 106
• 1.6. 아미노산 조성 분석 및 흡광 계수(Extinction Coefficient)의 측정 = 107
• 1.7. 자외선 흡광도 = 109
• 2. 구조적 특성 = 127
• 2.1. N-말단과 C-말단의 확인 = 127
• 2.2. Circular Dichroism에 의한 2차 구조 확인 = 127
• 2.3. 트립신에 의한 peptide mapping = 128
• 3. 생물학적 활성 = 137
• 3.1. Hypophysectomized rat을 이용한 몸 무게 증체 실험 = 137
• 3.2. 비유기 젖소에서의 산유량 증가 시험 = 138
• 4. 변형된 소 성장 호르몬의 확인 = 142
• 4.1. 2차원 전기 영동에 의한 확인 = 142
• 4.2. LC mass에 의한 확인 = 142
• 5. 변형된 소 성장 호르몬의 정제 = 147
• 6. 변형된 소 성장 호르몬의 생물학적 활성 = 154
• 7. 발효 방법의 최적화를 통한 변형체 생성의 최소화 = 156
• Ⅳ. 고찰 = 160
• 1. 물리 화학적 성질 = 160
• 2. 구조적 특성 = 160
• 3. 변형된 소 성장 호르몬에 대한 연구 = 161
• 3.1. 미세 전하 변형체 = 161
• 3.2. 미세 구조 치환체 = 162
• 4. 발효 방법의 최적화를 통한 변형체 생성의 최소화 = 163
• Ⅴ. 참고문헌 = 164