Development of hyaluronic acid and zinc ion-based cryoprotectant for enhanced cellular viability

국문 초록 (Abstract)

세포, 조직, 기관과 같은 생물학적 시료는 본질적으로 가변적이며, 배양이 지속되거나 계대배양이 반복될수록 유전적 특성이 변하고 초기와 다른 표현형을 나타내게 된다. 따라서 이러한 생물학적 시료의 보존은 연구와 임상에서 필수적이다. 특히, 최근 인공수정, 세포·유전자 치료제 및 항암제 개발의 확대로 인해 해동 후 본래의 기능성을 유지하는 동결 보존 기술에 대한 관심이 높아지고 있다.
동결보존은 연구 및 임상에서 가장 널리 사용되는 생체재료의 장기 저장법이다. 일반적으로, 액체질소의 온도인 -196℃에서는 분자운동과 생화학적 반응이 정지되어 시료의 변성을 최소화하여 유지할 수 있다. 그러나 세포 내외에서 발생하는 빙정(ice crystal)에 의해 동결 및 해동의 전 과정에서 세포 손상이 발생할 수 있다. 냉각 과정 중 세포 외부에 얼음이 형성되면, 용질 농축에 의해 삼투압이 급격히 변하며 세포 내에 ice crystal이 형성되어 세포 생존율이 감소한다. 해동 시, 온도 상승 속도가 느리거나 불균일할 경우 재결정화가 유발되며, 유리화된 시료에서는 탈유리화로 인해 빙정 성장이 촉진되어 해동 후 세포의 회복을 저해한다.
이러한 한계점을 극복하기 위해 두 가지의 동결 보존법이 보편적으로 적용되고 있다. 느린 동결은 투과성 동결보존제를 이용한 냉각 속도 제어를 통해 세포 외 얼음 형성을 유도하고, 삼투압에 의한 탈수를 유발하여 세포내 얼음 형성을 억제한다. 반면, 급속 냉각을 이용하는 유리화는 고농도의 동결보존제를 이용해 얼음 결정 형성을 회피한다. 그러나 고농도의 동결보존제는 시료 처리 및 탈수 과정에서 과도한 삼투압 변화나 화학적 독성에 의한 세포 스트레스를 초래할 수 있다. 이 때, 고분자 기반의 비투과성 동결보존제는 과도한 탈수를 억제하고, 세포 막단백질의 안정화를 돕는다. 그럼에도 불구하고 해동 직후의 세포는 여전히 대사 활성 저하, 부착 및 증식 효율의 감소, 더 나아가 세포사멸을 이르는 등 기능적 손상을 보이기도 한다.
이에 본 연구에서는 해동 후 세포의 생존율 향상과 기능 회복을 촉진시키기 위한 동결보존 첨가제로서 히알루론산과 아연이온에 주목했다. 히알루론산은 생체 적합성이 우수한 세포외기질(ECM)의 구성성분 중 하나인 고분자로 동결 중 세포의 삼투압을 조절해 세포의 생존율 향상에 기여하는 동결보존제의 역할을 하는 것으로 보고되었다. 또한 아연이온은 생체활성 인자로서 세포 증식, 혈관화 등의 세포 활성에 영향을 미치는 것으로 알려져있다. 이러한 히알루론산과 아연이온을 이용해 세포 손상을 최소화하고 세포 기능성 향상을 촉진하는 동결보존 소재를 개발하고자 하였다.
우리는 EDC/NHS 반응을 통해 서로 다른 분자량의 히알루론산에 티올기를 도입해 HA-SH를 합성하였다. 이후 이를 ZnCl2에서 유래한 Zn2+와 금속이온 배위결합을 통해 결합하여 HA-SH/Zn2+ 나노컴플렉스를 개발했다. 본 소재는 동결배지에 간단히 혼합하는 방식으로 사용되며, 동결보존 후 세포 생존율을 향상시키고, 일반 배양환경에서 세포의 증식 및 기능성 유전자 발현을 촉진시켰다. 따라서 본 연구의 HA-SH/Zn2+ 동결보존제는 비독성 환경 하에 세포의 생존율 및 활성 향상을 통해 재생의학 분야의 생물학적 시료 보관을 위한 동결배지 및 배지 첨가제로서 잠재력을 갖는다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Cryopreservation enables the long-term storage of cells, tissues, and organs at cryogenic temperatures. Recently, cryopreservation has attracted increasing interest due to the expansion of assisted reproduction and the growth of cell and gene therapies, which essentially require the cryopreservation of biological samples for further application. However, cryopreservation causes inevitable damage to biological samples. Therefore, reliable methods to protect the samples from the damage are important in research and clinical manufacturing. Cell recovery after cryopreservation depends on controlling ice crystal formation during both cooling and thawing. Ice crystals can physically damage cell membranes and cytoskeletal structures, leading to organelle destruction. In addition, secondary damage occurs when oxidative stress, osmotic imbalance, and repair pathway damage lead to the accumulation of chemical, biological, and genetic injuries. To mitigate these injuries through physicochemical mechanisms, diverse cryoprotectants (CPAs) are applied during cryopreservation. In general, CPAs are reported to lower the freezing point and inhibit ice crystal formation. However, these cryoprotectants exhibit toxicity to cells and sometimes require very high concentrations for vitrification. Therefore, the development of CPAs exhibiting low cytotoxicity with high cryoprotective efficiency is required. Hyaluronic acid (HA) is a promising high molecular weight polysaccharide CPA. It is known to regulate ice crystal formation and the osmotic balance of cells. Zinc ions (Zn2+) are reported as cryoprotective additives that can stabilize cell membrane by moderating lipid molecules and fluidity. In sum, these components suggest a complementary strategy to protect cells during freezing and thawing. Herein, we developed thiolated HA (HA-SH) and Zn2+ based nanocomplexes that enhance post-thaw cell viability. HA was modified with thiol groups to promote nanocomplex formation. Then the nanocomplexes were simply fabricated by mixing HA-SH with a zinc chloride solution, followed by filtration. The nanocomplexes showed great cytocompatibility under standard culture conditions. When they were added to the freezing media containing 10% of dimethyl sulfoxide, post-thaw cell viability was increased in human dermal fibroblasts (HDFs). The nanocomplexes also facilitated functional recovery under standard culture conditions. The HA- SH/Zn2+ nanocomplexes significantly increased proliferative activity. We observed that the upregulation of transforming growth factor beta-1 subsequently led to an increase in vascular endothelial growth factor. These effects indicate that our nanocomplexes effectively improve cellular activity after cryopreservation. In summary, HA-SH and Zn2+-based nanocomplexes could enhance the efficiency of traditional CPAs. We suggest that our polymer- and ion-based cryopreservation media additives have great potential as CPAs in the development of regenerative medicine.

목차 (Table of Contents)

• Abstact i
• Table of Contents iii
• List of Tables v
• List of Figures vi
• List of Abbreviations vii
• Chapter 1. General Introduction 1
• 1.1. Cryopreservation 1
• 1.1.1. The Process of Cryopreservation 4
• 1.1.2. Injury Druing Cryopreservation 7
• 1.2. Ice Inhibition Strategies 11
• 1.2.1. Cryoprotective Ability of HA 16
• 1.3. Post-thaw Cell Recovery 19
• 1.3.1. The Role of HA and zinc ion (Zn2+) in Cellular Functionality 20
• 1.4. Research Motivation and Approaches 22
• Chapter 2. HA-SH/Zn2+-based CPA 24
• 2.1. Introduction 24
• 2.2. Experimental Section 26
• 2.2.1. Materials 27
• 2.2.2. Synthesis and Characterization of HA-SH 28
• 2.2.3. Cytocompatibility of HA-SH and ZnCl2 31
• 2.2.4. Fabrication and Characterization of HA-SH/Zn2+ Nanocomplex 32
• 2.2.5. Cryoprservation With HA-SH/Zn2+ Nanocomplex and Post -thaw Viability 32
• 2.2.6. RNA Isolation and Gene Expression Analysis 34
• 2.2.7. Statistical Analysis 37
• 2.3. Results and Discussion 38
• 2.3.1. HA-SH Synthesis and Characterization of HA-SH and ZnCl2 38
• 2.3.2. Characterization of HA-SH/Zn2+ nanocomplex 41
• 2.3.3. Cryopreservation effect on the HDFs 44
• 2.3.4. Cell functionality Studies with HA-SH/Zn2+ Media 47
• Chapter 3. Conclusion and Future Direction 49
• Reference 50
• 국문초록 60
• Acknowledgement 63