사람 골수 중간엽줄기세포 유래 IGFBP6가 신경세포의 생존에 미치는 영향

국문 초록 (Abstract)

사람 골수 유래 중간엽줄기세포 (human bone marrow-derived mesenchymal stem cell; hMSC)는 자가증식능이 우수하고, 특정 세포로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있기 때문에 여러 신경계손상 질환의 치료에 적용 가능한 세포원 (cell source)이다. 현재까지 hMSC를 뇌졸중 (stroke), 척수손상 (spinal cord injury), 파킨슨병 (Parkinson’s disease)과 같은 신경손상에 적용하여 치료의 가능성을 보여주는 많은 연구 보고들이 있다. 이러한 신경보호 효과는 hMSC에서 분비되는 다양한 인자들에 의한 손상된 조직을 회복하기 위한 좋은 미세환경 구축에 주로 기인한다. 우리는 이전 연구에서 hMSC가 IGFBP6 (insulin-like growth factor binding protein 6)를 포함한 많은 인자들을 분비 하고 있다는 것을 보고했다. IGFBP가 결합하는 IGF (insulin-like growth factor)에는 IGF1과 IGF2, 두 종류가 있는데 IGFBP6는 IGF1보다 IGF2에 높은 결합 친화력을 가졌다. IGFBP6는 주로 IGF2를 매개로 성장하는 종양 (tumor)에서 성장을 억제한다는 것으로 알려져 있다. 최근 사람 섬유아세포 (fibroblast)에서 IGFBP6가 노화를 지연시키고 세포사멸을 억제하는 역할을 한다는 보고가 있으며, 세포의 종류에 따라 다르게 작용한다고 알려져 있다. 하지만 신경세포에서의 IGFBP6의 역할에 대한 연구는 많이 알려져 있지 않다. 따라서, 본 연구는 hMSC에서 분비되는 많은 인자들 중 IGFBP6가 손상 받은 신경세포에 대한 보호 기전을 살펴보고자 한다.
IGFBP6의 신경세포 보호작용을 연구하기 위해 랫트의 1차 배양 신경세포 (rat primary cortical neuron)와 마우스 신경아세포종 (neuroblastoma) 세포주인 Neuro2A 세포를 사용하였다. H2O2 (1차 신경세포: 5 μM, 10 μM, 15 μM, 20 μM, Neuro2A: 20 μM, 30 μM, 40 μM)를 처리함으로서 산화적 스트레스로 인한 세포사멸을 유도하였고 이로 인해 신경세포의 생존율이 현저히 감소하는 것을 확인 할 수 있었다. 그러나 H2O2로 유도 된 산화적 스트레스로 감소한 신경세포의 생존율이 hMSC 조건배지 (hMSC-conditioned media; hMSC-CM)를 처리하게 되면 생존율이 유의적으로 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 그리고 hMSC에서 분비 된 인자 중 IGFBP6가 세포보호에 관련이 있는지를 확인하기 위하여 hMSC-CM에 IGFBP6 중화 항체 (30 μg/ml) 를 사용하였다. hMSC-CM에 의해 증가한 신경세포의 생존율이 IGFBP6 중화 항체를 처리하면 그 효과가 현저히 감소하는 것을 확인하였다. 이는 IGFBP6가 산화적 스트레스에 의해 손상 받은 신경세포에 대한 보호 작용에 관여함을 시사하고 있다.
IGFBP6를 통한 hMSC-CM의 신경세포 보호기전을 연구하기 위해 신경세포에서 IGF의 세포내 보호기전으로 잘 알려진 Akt와 Erk의 활성을 각각의 억제제인 PD98059 (50 μM)과 wortmannin (100 nM)을 처리하여 확인하였다. hMSC-CM의 처리로 증가한 신경세포의 세포 생존율은 Akt 활성 억제제인 wortmannin을 처리하였을 때 유의적으로 감소하는 것을 확인하였고, 이는 1차 배양 신경세포에서 Akt의 활성이 보호기전으로서 작용한다는 것을 관찰하였다. 그리고 H2O2 처리 후 hMSC-CM에 의하여 30분과 60분에 Akt의 활성이 유의적으로 증가하였고, IGFBP6 중화 항체를 함께 처리하였을 때 Akt의 활성이 현저히 감소하는 것을 관찰하였다. 이는 IGFBP6가 세포내 Akt의 활성을 증가시키고 신경세포의 보호효과를 유도한다는 것을 시사하고 있다.
IGFBP6를 통한 hMSC-CM의 신경세포 보호효과가 신경조직에서도 일어나는지 확인하기 위해 척수손상 ex vivo 모델인 척수조직 절편 배양법을 이용하였다. 척수 조직 절편에 리소레시틴 (lysolecithin, 0.5 mg/ml)을 처리하여 조직에 손상을 가한 후, hMSC를 이식하거나 IGFBP6 중화 항체 (30 μg/ml)를 함께 처리하여 TUNEL 분석을 통해 세포사멸을 관찰하였다. 척수 조직절편에 리소레시틴을 처리하여 유의적으로 증가하는 세포사멸이 hMSC를 이식을 통해 현저히 감소하는 것을 관찰하였다. 하지만 IGFBP6 중화 항체를 함께 처리하여 TUNEL 분석을 하였을 때 hMSC를 단독으로 이식하였을 때 보다 세포사멸이 유의적으로 증가함을 확인하였다. 이와 같은 결과들은 hMSC에서 분비되는 인자들 중, IGFBP6가 손상 된 신경세포와 신경조직의 세포사멸 방지 기전에 관여한다는 것을 시사한다.

목차 (Table of Contents)

• 목 차
• I. 서론 --------------------------------------------------- 7
• II. 재료 및 방법 ------------------------------------------- 11
• III. 연구결과 --------------------------------------------- 16
• IV. 고찰 ------------------------------------------------ 23
• V. 참고문헌 --------------------------------------------- 28
• VI. Abstract --------------------------------------------- 35