The Characterization of the insA gene encoding INSIG a component of the ergosterol dependent oxygen-sensing pathway in Aspergillus nidulans : Aspergillus nidulans에서 ergosterol 의존적 산소인식 경로의 구성성분인 INSIG를 암호화하는 insA의 기능 분석

국문 초록 (Abstract)

Mammal에서 콜레스테롤과 지방산 합성은 막에 결합되어 있는 전사인자인 SREBPs (Sterol Regulatory Element Binding Proteins)에 의해서 조절된다. SREBPs의 활성화는 세포내의 스테롤농도에 의해 조절된다. SREBP는 합성된 후 즉시 SCAP (SREBP Cleavage-Activating Protein)과 결합한다. SCAP은 스테롤 인식 부위를 지니는 막 단백질로서 SREBP와 INSIG(Insulin-Induced Gene)와 결합한다. 스테롤의 고갈은 SCAP의 구조적 변화를 일으켜 INSIG에서 SCAP의 분리를 유도한다. SREBP와 SCAP의 결합체는 ER에서 Golgi로 이동하고 SREBP는 protease 1과 2에 의해 잘리게 되는데, 잘려진 SREBP의 N-terminal 부분은 핵으로 들어가 lipid 합성에 필요한 유전자들의 발현을 유도하게 된다. 그러나 스테롤이 축척되게 되면 스테롤과 결합된 SCAP은 INSIG와 결합하게 되고 SREBP는 ER에 머물게 된다.
Schizosaccharomyces pombe의 ergosterol 합성에 관련된 연구를 보면 mammalian의 SREBP pathway와 유사한 경로에 의해 작용함을 알 수 있다. 또한 이러한 시스템은 ergosterol합성에서 뿐만 아니라 산소 인식과 저산소에서 유도되는 유전자의 발현을 위해서도 필요함을 알 수 있다. SREBP와 이의 negative 조절자인 INSIG의 유사 단백질을 Aspergillus nidulans에서 찾을 수 있었으며, 이는 각각 hitA와 insA라 밝혀졌다. 선행 연구에서 hitA가 ergosterol 합성과 저 산소 조건에서 성장하는데 있어 필수적인 유전자임을 확인한 바 있다. hitA null mutant는 저산소 조건(1% 02)에서 성장하지 못하며, ergosterol 합성에 수반되는 lanosterol 14-alpha demethylase의 억제물질인 itraconazole에 민감성을 보였다.
본 연구에서는 mammalian INSIG의 A. nidulans homolog인 insA를 cloning하여 분석하였다. InsA와 human INSIG의 아미노산 유사성은 높으며, insA null mutant는 일반적인 산소 조건이나 저산소 조건에서 야생주와 다른 표현형을 보이지 않았다. 반면 alcA promoter조절 하에 InsA를 과대발현시키면 itraconazole에 높은 민감성을 보이는데 이는 HitA의 활성이 억제되고 있음을 의미한다. 이러한 InsA 과대발현 균주에서 itraconazole 민감성은 HitA와 HitA N-terminal region을 각각 InsA와 동시에 과대발현 시켰을 때 회복되는 것을 확인할 수 있었다. 반면 HitA C-terminal region은 InsA와 동시에 과대발현을 시켜도 itraconazole에서 야생주처럼 회복되지 않았다.
저산소 조건과 itraconazole를 처리했을 시 hitA의 발현은 상당히 증가하는 반면, insA의 발현은 감소하는 것을 확인하였다. 반면 InsA의 과대발현 시에 hitA의 발현이 억제되는 것을 알 수 있었다. 나아가 insA null mutant에서 hitA의 발현이 공기 중에서나 저산소 조건 시에서 동일한 발현정도를 나타내어 변화를 보이지 않음을 Northern 분석을 통해 확인 할 수 있었다. 이러한 결과는 InsA가 mammal에서와 유사하게 HitA의 활성에 negative하게 작용함을 의미한다. 더불어 A. nidulans에서 HitA 단백질은 hitA 유전자의 발현에 있어 자가조절 (auto-regulation)을 할 것이라 예상할 수 있다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Cholesterol and fatty acid synthesis in mammals are controlled by Sterol Regulatory Element Binding Proteins (SREBPs), a family of membrane-tethered transcription factors. Activation of SREBPs is regulated by sterol concentration within the cell. SREBP interacts with SREBP Cleavage-Activating Protein (SCAP), immediately after synthesized. SCAP is a membrane protein containing the sterol-sensing domain and associated with SREBP and Insulin-Induced Gene (INSIG). Sterol depletion caused conformational change of SCAP resulting to dissociation of SCAP from INSIG. Then, SREBP-SCAP complex moves from endoplasmic reticulum (ER) to golgi, where SREBP was cleaved by site-specific protease 1 and 2. The cleaved N-terminus of SREBP is translocated to the nucleus and activates genes which are necessary in lipid biosynthesis. If sterol is accumulated, the sterol-bound SCAP forms a tight complex with endoplasmic resident protein INSIG, so that SREBP stays in ER.
The studies identified that ergosterol synthesis of Schizosaccharomyces pombe but not in S. cerevisiase is also regulated by a mammalian SREBP pathway like regulatory system. Moreover this system is not only responsible for ergosterol synthesis but also necessary for oxygen sensing and hypoxic gene expressions. The homologs of the mammalian SREBP-1 and its negative regulator INSIG-1 were also found in a genetic model organism Aspergillus nidulans, and named hitA and insA, respectively. Our previous study determined that hitA is essential for both ergosterol synthesis and hypoxic growth. hitA null mutant did not grow in hypoxic environment (1% O2) and exhibited high sensitivity to itraconazole, an inhibitor of lanosterol 14-alpha demethylase involved in the ergosterol synthesis.
In this study, an A. nidulans INSIG-1 homolog, insA was cloned and analysed. InsA showed high amino acid similarities to human INSIG-1. Null mutants of insA showed no significant phenotypic difference compared to its wild-type in both normoxia and hypoxia. In contrast, over-expression of InsA under the control of inducible promoter alcA caused cells to show high sensitivity to itraconazole, indicating that activation of HitA was prevented. Such an inhibition in the InsA over-expressed strains was rescued by co-overexpression with HitA or the HitA N-terminus but not with the C-terminus of HitA turning back into the wild-type phenotype in the presence of itraconazole.
In hypoxia and in the presence of itraconazole, hitA transcription was considerably induced, while the level of insA transcripts was reduced compared to that shown in normoxia and cultures without itraconazole. However, such a transcription induction of hitA was prevented when InsA was over-expressed. Furthermore, in insA null mutants the level of hitA transcripts in normoxia was enhanced similar to that in hypoxia showing no difference by Northern analysis. These results implied that InsA playes a negative role on the HitA activation similarly shown in mammals. In addition, an auto-regulation of HitA was predictable in A. nidulans.

목차 (Table of Contents)

• I. INTRODUCTION = 1
• 1.1. Study object = 1
• 1.2. A. nidulans is a genetic model organism = 2
• 1.3. The life cycle of A. nidulans = 3
• 1.4. The genome of A. nidulans = 5
• 1.5. The sterol regulatory element binding protein pathway = 5
• 1.5.1. Sterol regulatory element binding protein = 5
• 1.5.2. SREBP Cleavage activating protein = 6
• 1.5.3. Insulin induced gene: Insig = 7
• 1.6. SREBP in non-mammalian system = 10
• 1.7. Sterol biosynthesis and oxygen sensing = 10
• 1.7.1. Ergosterol = 10
• 1.7.2. Ergosterol biosynthesis and oxygen sensing = 12
• 1.8. Antifungal agents = 15
• II. MATERIALS AND METHODS = 16
• 2.1. Strains used in this study = 16
• 2.2. Plasmids = 17
• 2.3. Media and growth condition = 17
• 2.3.1. Aspergillus nidulans = 17
• 2.3.2. Escherichia coli = 19
• 2.4. Molecular techniques for A. nidulans = 19
• 2.4.1. Genomic DNA isolation = 19
• 2.4.2. Southern blot analysis = 20
• 2.4.3. Total RNA isolation = 21
• 2.4.4. Northern blot analysis = 22
• 2.4.5. Double-Joint PCR for gene disruption = 23
• 2.4.6. Transformation to A. nidulans = 25
• 2.4.7. Cloning and Over-expression = 27
• III. RESULTS = 31
• 3.1. The insA gene of A. nidulans = 31
• 3.2. Disruption of insA = 35
• 3.2.1. Phenotype of insA disruption mutants = 38
• 3.3. Over-expression of InsA = 39
• 3.3.1. Phenotype of InsA over-expressed strains = 40
• 3.3.2. hitA and ergA expressions in the InsA over-expressed strains = 43
• 3.4. Co-overexpressions of the InsA and HitA = 45
• 3.4.1. Phenotypes of co-overexpressed strains = 46
• 3.5. Transcription of hitA is induced in hypoxia and in the presence of itraconazole whereas insA is repressed = 49
• 3.5.1. Hypoxic stress test in wild type = 49
• 3.5.2. Itraconazole stress test in wild type = 50
• 3.5.3. Hypoxic stress test in insA disruption mutant = 52
• 3.6. hitA expression is negatively regulated by InsA = 53
• 3.7. HitA regulates insA and ergA expressions = 54
• IV. DISCUSSION = 56
• V. REFERENCES = 59
• Summary (in Korean) = 65
• Acknowledgement = 67